1. 每个分析反应按以下比例将各反应组分加入 1.5 ml 微量离心管中: 10 μl 5 × 酪蛋白激酶反应缓冲液 5 μl 10 mmol/L用于酪蛋白激酶分析的合成肽底物溶液 5 μl [γ-32P] ATP溶液(ATP终浓度为5 μmol/L,放射活性为5 μCi/μl) 0~30 μl 水 盖好离心管,放入 30℃ 水浴温育 10 min。每个反应的容积为 50 μl,加入水的量取决于加入酶样品的量。
2. 加入 1~30 μl 有酪蛋白激酶活性的酶样品开始反应。
3. 30°C 水浴,10 min。
4. 按不同的分析目的和方法加入适当的试剂停止反应:20 μl 预冷 10 % TCA 进行 TCA 沉淀,或 10~20 μl 预冷的 2 × SDS-PAGE 样品缓冲液进行电泳分析。 可用 10 μl 的反应混合物点膜,使酶吸附在 P81 磷酸纤维素膜上。用那些方法中的一种继续进行分析。 展开 |