一、挑取酵母受体菌的新鲜的单菌落(4℃放置不超过3周的也可以),接种到装在50 mL 离心管中的10 mL的自备的YPD培养基中。 二、30℃摇晃培养,摇床速度250 rpm/分钟,直到OD600达到0.6-1.0(相当于0.6-1x107细胞/mL)。 三、室温3 000 rpm离心5 min,弃上清得酵母细胞沉淀。 四、新鲜制备适量的酵母感受态制备工作液。对10 mL酵母需要5.25 mL的工作液,其配制方法是:将4.75 mL制备液A、0.25 mL制备液B和0.25 mL制备液C加入到一个无菌的离心管中后充分震荡混匀即可。酵母感受态制备工作液可放室温待用。 五、用0.5倍体积的新鲜配制的酵母感受态制备工作液洗涤酵母细胞沉淀一次(对10 mL酵母则需要5 mL酵母感受态制备工作液)。即混合后振荡1分钟,室温3 000 rpm离心3分钟,去上清得洗涤后的酵母细胞沉淀。 六、再用0.02倍体积的酵母感受态制备工作液充分重悬菌体(对10 mL酵母,则需要0.2 mL酵母感受态制备工作液)。 七、按每管0.2 mL分装到冷冻管中,放入保温冰盒中冷却半小时后再放入-80℃冰箱待用。0.2 mL的感受态细胞足够1次转化使用。 收起 |