酵母转化实验

实验材料 酵母

试剂、试剂盒 YPDYPAD腺嘌呤半硫酸TE乙酸锂

仪器、耗材 摇床水浴锅转子离心机培养箱

实验步骤

1.  在开始实验前2天，接种待转化的酵母菌株的单菌落于5 ml YPD培养基中，于30℃恒温摇床，培养过夜。
 
2.  转化的前一天晚上，往1 L 无菌烧瓶中加入300 ml YPAD培养基，然后接种适量的过夜培养液，再于30℃培养过夜，到细胞密度为1×107 细胞/ml （OD600≈0.3~0.5，依据菌株而定）， 为了获得2~3倍高的转化效率，用YPAD稀释培养液至细胞密度为2×106细胞/ml。然后培养生长2~3代（2~4 h）。
 
3.  培养液在室温条件下，4 000 g 离心5 min，收集细胞。细胞用10 ml 无菌超纯水重悬，然后转移到一个更小一些的离心管中，再于室温下，5 000~6 000 g 离心5 min，沉淀细胞。
 
4.  细胞用1.5 ml 锂盐溶液重悬，锂盐溶液按下列方法配制，现配现用。

（1）1体积，10×TE缓冲液，pH7.5

（2）1体积，10×乙酸锂贮液

（3）8体积，无菌超纯水
 
5.  每次转化时，200 μg 担体DNA和≤5 μg 转化DNA一起加入1.5 ml 微量离心管中混匀，DNA的总体积≤20 μl。
 
6.  往每个离心管加入200 μl 用锂盐溶液重悬的细胞悬液，再加入1.2 ml 新鲜配制的 PEG 4000溶液。PEG 4000溶液配方为：

（1）8体积，50%PEG

（2）1体积，10×TE缓冲液，pH7.5

（3）1体积，乙酸锂贮液

（4）30℃摇荡温育30 min。

7.  于42℃热休克15 min，室温下离心5 s，细胞沉淀用200 μl~1 ml 1×TE缓冲液重悬，并取其中200 μl 涂布在Difco琼脂制备的CM省却成分培养平板上。30℃培养2~5天，直到Difco琼脂平板上出现转化子。