| 实验步骤 | 一、材料
1. 缓冲液和溶液
异丙醇
醋酸钾（5 mol/L )
SDS (10%, m/V)
醋酸钠（3 mol/L，pH 7.0)
山梨糖醇缓冲液
TE ( pH 7.4)
含 20 μg/ml RNase 的 TE ( pH 8.0 )
酵母重悬浮缓冲液
2. 酶及其缓冲液
酶解酶 100T
3. 培养基
YFD 培养基
4. 离心机及其转头
Sorvall SS-34 转头或同类产品
5. 专用设备
预置至 65℃ 的水浴
6. 载体及酵母细胞株
酵母细胞
二、方法
细胞培养及其 DNA 的抽提
1. 用 10 ml YPD 培养基培养酵母。将酵母培养物在 30℃、中度振荡条件下培养过夜。
2. 取 5 ml 培养细胞置于离心管中。2000 g ( Sorvall SS-34 转头，4100 r/min）离心 5 min, 收集细胞。将剩下培养物置于 4℃ 储存。
3. 用 0.5 ml 山梨糖醇缓冲液重新悬浮细胞。将细胞悬液转移到一只微量离心管中。
4. 加入 20 μl 酶解酶 100T 的溶液（用山梨糖醇缓冲液配成 2.5 mg/ml 浓度)。将细胞悬液在 37℃ 下温育 1 h。
5. 用微量离心机离心 1 min, 收集细胞，吸弃上清液。
6. 用 0.5 ml 酵母重悬缓冲液重新悬浮细胞。
7. 加入 50 μl 10% 的 SDS。盖上管盖，将离心管快速地翻转数次，混匀后将离心管在 65℃ 下温育 30 min。
8. 加入 0.2 ml 5 mol/L 的醋酸钾溶液，冰浴 1 h。
DNA 的分离
9. 在微量离心机中以最大转速 4℃ 离心 5 min, 使细胞碎片沉积下来。
10. 室温下用粗孔吸头吸取离心上清，转移到一个新的微量离心管中。
11. 加入等体积室温下的异丙醇，沉淀核酸。将管内容物混匀，室温下放置 5 min。
12. 在微量离心机中以最大转速离心 10 s 回收核酸沉淀。吸去离心上清液，将沉淀在空气中干燥 10 min。
13. 用 300 μl 含 20 μg/ml 胰 RNase 的 TE ( pH 8.0 ) 溶解沉淀。将消化混合物在 37℃ 温育 30 min。
14. 加入 30 μl 3 mol/L 的醋酸钠（pH 7.0）。混匀后，加入 0.2 ml 的异丙醇。再次进行混匀。在微量离心机中以最大转速离心 20 s, 使 DNA 沉淀。
15. 吸去上清液，沉淀在空气中干燥 10 min, 用 150 μl TE ( pH 7.0）溶解 DNA。 |
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