酶切实验

采用粘末端连接必须对目的DNA分子和载体分子进行酶切以获得相应的粘末端进行连接。酶切可以是单酶切也可以是双酶切。单酶切操作比较简单，但双酶切如果两种酶所用缓冲液成分不同（主要是盐离子浓度不同）或反应温度不同，这时可以采用如下措施解决：1）先用一种酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一种酶切；2）先进行低盐要求的酶酶切，然后添加盐离子浓度到高盐的酶反应要求，加入第二种酶进行酶切；3）使用通用缓冲液进行双酶切。具体要根据酶的反应要求进行，尽量避免星号活力。

质粒DNA

限制性核酸内切酶 蒸馏水

微量移液枪 离心机 电泳仪 水浴锅 紫外透射观测仪 离心管 记号笔

一、实验材料准备
 

1.  材料：质粒DNA。
 

2.  试剂：限制性内切酶、ddH₂O。
 

3 .  仪器：微量移液枪，离心机，水浴锅， 电泳仪，紫外透射观测仪。
 

二、单酶切

1.  在1.5 mL灭菌离心管中依次加入：

（1）质粒DNA：X uL（约1 ug）。

（2）限制性内切酶：1 uL（约10 U）。

（3）10xbuffer：2 uL。

（4）ddH₂O：补足20 uL。

2.  混匀，做好标记。

3.  37℃水浴1-3 h。

4.  70℃水浴10 min中止反应。

5.  电泳检测酶切效果。

三、双酶切

1.  在1.5 mL灭菌离心管中依次加入：

（1）质粒DNA：X uL（约1 ug）。

（2）限制性内切酶1：1 uL（约10 U）。

（3）限制性内切酶2：1 uL（约10 U）

（3）10xbuffer：1或2 uL。

（4）ddH₂O：补足20 uL。

2.  混匀，做好标记。

3.  37℃水浴1-3 h。

4.  70℃水浴10 min中止反应。

5.  电泳检测酶切效果。

四、结果与分析

假若一种酶在环状质粒DNA中只有一个酶切位点， 且酶切彻底，紫外灯下检测电泳结果，则单酶切应为一条带， 而双酶切则为两条带。如果条带数目多于理论值，那么有可能是酶切不完全。如果酶切结果与酶切前的质粒条带一样（超螺旋、线性和开环三条带），则说明质粒完全没有被切开。

1.  酶切的选择原则一般是尽量扩大酶切体系，这样抑制因素得以稀释；基因组DNA或质粒DNA酶的用量较一般DNA大，一般为1 ug/10U；所加酶的体积不能超过酶切总体积的1/10，否则甘油浓度会超过5%，会产生星号活力；对难切的质粒或基因组DNA应延长反应时间4―5hr， 甚至过夜。灭活限制性内切酶活性可以采用加热灭活，乙醇沉淀，酚/氯仿抽提，添加EDTA或SDS等方法，具体每一种酶可能有些方法不能完全灭活，这一点需要注意。

2.  双酶切体系缓冲液添加量要根据两种限制性内切酶最佳缓冲体系，可以登录限制性内切酶购买公司官方查看。