酶联免疫吸附实验—双抗体夹心ELISA法检测特异性抗体

双 抗 体 夹 心 ELISA 法检测特异性抗体

在有少量酶标特异抗体但无法获得纯化抗原时，用该检测方法筛选特异性抗体最为有 效（图 1.1. 4)。另外，这种方法也可利用那些结合同一抗原的不同单克隆抗体来绘制抗原表位图。

附 加 材 料（其他材料见基本方案）

包 被 抗 体 溶 液（特异性针对待测种属免疫球蛋白的抗体，不结合抗原或标记抗体）碱性磷酸酶标记的针对抗原的特异性抗体

1.用 50ul 的 2ug/ml 或 lOug/ml 包被抗体溶液包被 Immulon 微量滴定板，并封闭板孔
(见基本方案，步 骤 2〜5)。用较低浓度分析杂交瘤上清液或腹水，较高浓度用于分析抗血清。

2.用封闭缓冲液按 1 : 5 或 1 : 200 (V/V) 分别稀释杂交瘤上清液、抗血清或腹水，配制待测抗体溶液。在已包被孔中加入 50M 1，室 温 下 孵 育 2 h 以上，洗 涤（见基本方案 ，步 骤 7)。

3.用封闭缓冲液配制 20〜200ng/m l 的抗原溶液。往抗体包被孔中加入 50ul 等量抗原溶液 ，室温下孵育 2 h 以上，洗涤。
4 . 板孔中加入 50/xl 碱性磷酸酶标记的针对抗原的特异性抗体（通 常 是 25〜500ng 特异性抗体/ml) ，室温下孵育 2 h，洗涤。

酶标抗体浓度应足够高，保 证 NPP 为底物时在 405nm 下产生大约 0 •5 0 吸光度单位/h 的光强度，或 MUP 为底物时产生 1000〜1500 荧光吸光度单位/h。应注意在可得到试剂条件下设置阳性对照系统。

5.每孔中加入 75ul MUP 或 NPP 底物溶液，室温下孵育 lh。然后，目测检查酶解作用或用分光光度计定量测定（见基本方案，步 骤 9)。如要检测低水平反应，酶解作用数小时或数天后再次测定。

6.检测出的抗原特异性抗体应重新筛选以确定是否为假阳性。每个阳性样本中，用捕获抗体包被 4 个板孔，并将待测抗体和包被抗体结合在一起（步 骤 1 和 2)。用抗原孵 育 2 孔（步 骤 3)，另 2 孔用封闭缓冲液封闭， 4 孔 内 都 加 入 酶 标 抗 体 和 底 物（步骤 4 和 5)， Ih 后检测显色反应。