采用PCR技术插人表位标记物

   许多表达载体可能没有能够克隆标记物的合适的限制性酶切位点。在这种情况下，采用PCR技术将多肽标记物插入到已经克隆化的开放阅读框。在设计PCR正向和反向引物时，可引入较长的片段以在蛋白的氨基或羧基末端引入多肽标记物。，选择用于编码标记物特定氨基酸的密码子，使其能够用于表达标记蛋白的生物系统中。引物设计时应加入新的限制性酶切位点，以便PCR产物的克隆。应在引物限制性部位5^，端添加额外的碱基，这些“增添”的碱基有利于限制酶对PCR产物进行有效的切割。同时需注意保持正确的阅读框和根据需求设计起始密码和终止密码子。使用Kozak的保守翻译起始序列5^，—CCACCATGG-3’代替单一的ATG起始密码，可在真核细胞中进行有效的翻译。稍为复杂的PCR程序可以将肽标记物为一个阅读框内融合蛋白形式，插入到开放阅读框的任何一个部位。这些技术在许多克隆手册中均有描述，在此仅给出一个简单的例子以说明应考虑的因素。

    举例：采用PCR技术将HA标记物插入到周期素（cyclin）结合蛋白的氨基末端并在正。coli中表达

    设计PCR的正向引物（氨基末端HA标记物）有3个目的：

    （1）编码HA标记物；

    （2）与周期素结合蛋白YFP2开放阅读框的5，端杂交；

    （3）创建新的限制性酶切位点以便将编码新的标记蛋白的PCR产物克隆到表达载体中。

当标记氨基末端时，需要创建一个新的起始甲硫氨酸以避免破坏正确的翻译起始信号。如果克隆到真核系统中进行表达，则需在此处引入Kozak保守序列，在本例选用（pET-5a）作为表达质粒。

    1．表位标记物的序列

    Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

     Y   P   Y   D   V   P   D   Y   A

    选择E．coli和人类常用的密码子。

    TAC CCA TAC GAC GTG CCA GAC TAC GCT

选择一段重叠序列，将标记物置于YFP2的氨基末端。通常有18～21bp的重叠序列即可。希望Tm温度在55～80℃之间，尽可能避免连续3个C或G，且避免引物在3，端互补或者具有明显的二级结构。可使用软件程序进行正确的引物设计。但是，一个简单的经验是，每对AT提供2℃熔链温度，而每对GC提供4℃熔链温度。

    2．YFP2的氨基末端

    ATG GAC CCG GCG GCG GGG AGC

     M   D   P   A   A   G   S

    然后再创建限制性酶切位点。在本例中，所创建的位点并不在开放阅读框中：本例选择创建一个NdeI酶切位点，以编码起始甲硫氨酸和有利于克隆到表达载体中。同时，添加GC以利于对PCR产物进行有效的限制性消化和防止PCR产物末端的破裂。

    GC CATATG

    结合上述要素，设计正向引物，预定以下寡核苷酸

    5^，—GC CATATGTAC CCA TAC GAC GTG CCA GAC TAC GCT ATG GAC CCG GCG GCG GGGAGC-3^，

反向引物可设计成为开放阅读框的末端引物，并创建一个适当的限制性酶切位点。

    3．YFP2在羧基端的序列

    GGT CCC TCA GAC ATC CCC GAT TGA

     G   P   S   D   I   P   D   x

    4．因与基因的该区域杂交并创建一个在片段另一端进行克隆所需EcoRI酶切位点的反向引物

    GC GAA TTC TCAATC GGG GAT GTC TGA GGG ACC

    为使用现有的编码YFP2基因的质粒作为模板进行PCR，需要根据所使用的具体设备，仔细地进行优化，以设计合适的反应条件；这些优化程序可以参见Dieffenbach和Dveksler（1995）的文献。

如果得到大小正确的产物，就可将产物从凝胶中切下，使用PCRprepDNA纯化系统进行纯化，然后以EcoRI和NdeI进行限制性消化，并连接到经过适当处理的载体上去。在本例中，克隆到可在正．coli中表达的且含有合适酶切位点的pET-5a载体上。NdeI部位提供了起始甲硫氨酸。

    5．新的氨基端

    M Y P Y D V P D Y A M D P A A G S。。。

    |————一标记物——一|——YFP2——