重组质粒转化感受态大肠杆菌

实验概要

              细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化(Transformation)是指重组质粒导入受体细胞的过程，使之获得新的遗传性状的一种手段。其原理是细菌处于0℃，CaCl₂低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。

主要试剂

        CaCl2（0.1M），LB培养基，琼脂，氯霉素（Cm）

主要设备

        恒温水浴锅，台式离心机，超净工作台，振荡培养箱

实验步骤

CaCl₂法制备大肠杆菌感受态细胞，使用DNA片段和质粒载体pYLVS酶切后的连接产物进行转化：

1.   取一甘油保存的DH5α菌种接种于5mL LB试管中，于恒温振荡培养箱上37℃培养16hr以上。同时作Cm阴性对照管。 2.   用移液管无菌条件下取过夜培养液0.2mL，按1%量接种于新鲜的LB中（20mL/100mL三角瓶）。菌液置恒温振荡培养箱上37℃培养3hr。 3.   无菌条件下，将上述菌液分装1mL入1.5mL eppendorf管中。 4.   冰浴10min，5000rpm离心2min。 5.   管口朝下轻甩数次倒干净上清。加入600L预冷的100mM CaCl2溶液，混匀后冰浴30min。 6.   5000rpm离心2min，小心倒掉上清CaCl2，留沉淀菌体。 7.   将菌体悬浮于100L的100 mM CaCl2溶液中，4℃保存。菌体在此步骤后的一周内均可使用。 8.   无菌条件下，取10-20L连接反应液加入到含100L大肠杆菌感受态细胞的离心管中，混匀，冰浴30min。 9.   42℃恒温水浴锅中保温90s，过程中勿晃动离心管。立即转移到冰水浴中。 10. 加入900L LB培养液，置37℃水浴1hr，每10min翻动一次。 11. 取0.1-0.2mL的连接液转化菌液直接涂布于含氯霉素（Cm）的LB固体培养基上。同时涂布无Cm的对照。 12. 置37℃生化培养箱15min，待菌液吸收完全后，倒置培养16-20hr。

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