金标准qPCR仍无法有效检查BCRABL，怎么办？

　　慢性粒细胞白血病（Chronic Myelocytic Leukemia，下文简称 CML），是一种影响血液及骨髓的恶性肿瘤，抑制骨髓正常造血，通过血液扩散全身，导致病人出现贫血、容易出血、感染以及器官浸润等病症。

　　监测 CML 疾病负荷的常规方法有三种：

　　血液学反应（HR）-评估血细胞计数和分化

　　细胞遗传学反应（CyR）-骨髓细胞中期染色体带型分析

　　分子学反应（MR） -BCR-ABL 转录本水平相对于对照基因的检测

　　目前，BCR-ABL 水平检测因其结果简单、准确且意义明确而被积极采用，且相对于细胞遗传学水平来说检测 BCR-ABL 水平会更加简便，仅需进行血液检测，无需骨髓活检。国际临床试验结论来自 BCR-ABL IS 数据，CML 治疗指南的制定也是基于这一指标。此外，BCR-ABL 融合基因检测对于前期 CML 疾病辅助诊断及后续靶向用药指导及残留病监测方面亦具有临床意义。

　　那么为什么要检测 BCR-ABL 水平呢？

　　研究人员发现 CML 患者体内 22 号染色体更短，后续研究指出是因为这类患者体内 9 号染色体上的 ABL 基因会与 22 号染色体上的 BCR 发生里交换，形成 BCR-ABL 融合基因，该基因可转录出一个 8.5kb 的异常 mRNA，最终翻译成 210kD 大小的蛋白质——P210，P210 具有较强的酪氨酸蛋白激酶活性，可通过多种信号转导途径来活化原癌基因和某些细胞因子，导致细胞的恶性转化。

　　Ps: >95% CML 病例为 P210「b3a2/b2a2」（或称「e14a2/e13a2」，下图红框标记）型。

　　国际上如何利用 BCR-ABL 水平指导临床？

　　%IS：International Scale percent ratio

　　CF：转换因子（将一个特定的实验室中得到的 BCR-ABL 值与从一个中心参考实验室特定样本得到的一组 BCR-ABL 值进行比较，CF 值需要定期进行重新评估）

　　MR：Molecular log Reduction level

　　即通过检测 BCR-ABL 及 ABL 水平结合每个实验室的 CF 值来计算 %IS 值，然后通过 %IS 值反应 MR 水平，最后借此指导临床治疗，调整治疗方案。下表中 MMR 意为主要分子学反应，是目前 CML 患者的重要治疗目标。

　　如何检测 BCR-ABL 水平？

　　提示：目前临床上检查 BCR-ABL 融合基因的金标准是 qPCR 技术，但由于 qPCR 技术的定量检测依赖标准的参考物质。此外 qPCR 技术的技术局限导致检测灵敏度不够高，对微小残留病无法实现有效监测。

　　那么有没有一种技术/一款试剂盒能够高灵敏度地对 BCR-ABL 融合基因进行准确定量呢？答案是有的。

　　众所周知，Bio-Rad QX200 微滴式数字 PCR 技术（下文简称「ddPCR」）以分子计数的方式实现对靶标核酸分子的绝对定量。相对荧光定量 PCR 技术来说，ddPCR 技术不依赖于标准曲线，且灵敏度、重复性和准确性有很大提高。在癌症分子标志物发现、病毒载量分析、传染病研究、基因组结构变异及 NGS 文库定量方面都得到了广泛应用。

　　QXDx BCR-ABL %IS 试剂盒是 Bio-Rad 推出的基于 QX100/200 微滴式数字 PCR 平台的 BCR-ABL 融合基因定量检测试剂盒，灵敏度可达 MR4.7 或 MR5.0 水平。更值得一提的是该款试剂盒在 2017 年 12 月份获得了 CE-IVD 认证，这也是第一个在欧洲获批的、针对血液样本的BCR-ABL 定量检测试剂盒，目前也在申报美国 FDA 认证。

　　如何利用该试剂盒进行 BCR-ABL %IS 水平检测呢？

　　该试剂盒中除了反转录需要的试剂、引物、ddPCR 过程中需要引物探针外，还内置一系列 Control 及 Calibration 样本，确保检测结果的有效性、准确性。

　　Controls：

　　高水平阳性对照  -MR0.3-MR1.0 (10%-50%IS)

　　低水平阳性对照  -MR3.0-MR5.0 (0.001-0.1%IS)

　　阴性对照  -< MR5.3 (0.0007%IS)

　　Calibrations：~0.1%IS 和 ~10%IS

　　该试剂盒与 qPCR 结果一致性，灵敏度、特异性检测结果如下：

　　参考文献：

　　[1] Jennings L.J, George D, Czech J, Yu M, Joseph L. Detection and Quantification of BCR-ABL1 Fusion Transcripts by Droplet Digital PCR. The Journal of Molecular Diagnostics. 2014 Mar；16(2):174-9.

　　[2] Cross N.C, White H.E etc. Development and evaluation of a secondary reference panel for BCR-ABL1 quantification on the International Scale. Leukemia. 2016 Sep；30(9):1844-52.

　　[3] Zagaria A, Anelli L, Coccaro N etc. BCR-ABL1 e6a2 transcript in chronic myeloid leukemia: biological features and molecular monitoring by droplet digital PCR. Virchows Arch. 2015 Sep；467(3):357-63

　　[4] Tang Y, Wei X, Chen J, Du Y, Chu H etc. Absolute quantification of BCR-ABL1 fusion transcripts in pediatric chronic myeloid leukemia. Leuk Lymphoma. 2016 Sep；57(9):2216-8.