钙调蛋白的苯基Sepharose层析实验

含钙调蛋白的组分 CaCl2(固体) 碳酸氢铵 缓冲液 E 缓冲液 F

透析袋 苯基-Sepharose*4B 填料 玻璃层析柱 蠕动泵 紫外线检测器、分部收集器和硼硅玻璃试管 冻干机 冷冻干燥器

材料与设备

含钙调蛋白的组分，从 DEAE 柱收集后合并所得（见实验 4)

透析袋（标称截留分子量 6000~8000Da; 已清洗过)

苯基-Sepharose*4B 填料（已溶胀（Pharmacia Biotech,Inc.)

玻璃层析柱（直径 2.5 cmX10 cm)

CaCl₂(固体)

层析装置：蠕动泵，紫外线检测器、分部收集器和硼硅玻璃试管（13x100 mm)

碳酸氢铵（10 mmol/L;pH8.0)(8000 ml)

冻干机/冷冻干燥器

试剂

缓冲液 E(500 ml)

含 0.2mol/LNaCl 的缓冲液 E(200 ml)

含 8mol/L 尿素的缓冲液 E(100 ml)

缓冲液 F(500 ml)

含 0.2mol/LNaCl 的缓冲液 F(200 ml)

(配方，见“试剂的配制”，PP.82~83)

操作程序

一.透析

1) 戴上手套，将从 DEAE 柱收集后合并的含钙调蛋白的组分转移至透析袋。透析袋两端至少打双结扎紧，或用夹钳夹紧。

2) 对缓冲液 F 透析过夜。

二.疏水作用层析

1) 用缓冲液 E(不含 NaCl) 洗涤苯基-Sepharose 填料，以除去储存填料用的乙醇。于缓冲液 E 中以 50% 的悬浆储存备用。

2) 将约 40 ml 的苯基-Sepharose 填料装人一根 2.5x10-cm 的玻璃柱。用缓冲液 F(不含 NaCl), 以约 2 ml/min 的低流速淋洗几个柱体积，平衡柱子。

3) 将透析袋中的存留液小心地转人一烧杯中。记下体积。留取约 1% 供分析用，并记下该体积。不论透析后的样品中含有什么，均加人固体 CaCl₂ 至终浓度 1 mmol/L，以保证钙离子处于饱和状态。

4) 给苯基-Sepharose 柱加样，在加样过程中让样品结合 30~60 min。

5) 用含 0.2mol/LNaCl 的缓冲液 F 洗柱约 2~4 体积（60~120 ml)。将清洗液收集于一烧杯或烧瓶中。

6) 除去柱顶部的所有缓冲液。用含 0.2mol/LNaCl 的缓冲液 E 洗脱，分部收集 2~4-ml 组分。监測紫外吸收，吸收峰回至基线后停止。

7) 用含 8md/L 尿素的缓冲液 E 彻底清洗柱子。用缓冲液 E 再生并保存柱子。

8) 对各组分作 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，检测钙调蛋白洗脱液。HIC 实验的典型结果见图 1-8。

9) 合并含钙调蛋白的组分，对 10mmol/L 碳酸氢铵（pH8.0) 透析，然后冻干。称量最终干燥的钙调蛋白样品。每千克（湿重鸡胗组织一般能获得 25~40 mg 的纯钙调蛋白。尽管碳酸氢铵容易挥发，但样品中可能会有一些干重物不是蛋白质。可以将样品溶于水后再冻干。另外，也可以对纯水进行彻底透析，但在这样的条件下可能会产生沉淀，而导致蛋白质回收的机械性损失。