链霉亲和素,HRP标记操作步骤及相关介绍

链霉亲和素,HRP标记(Streptavidin,HRP conjugated)操作步骤：

(一)获得目的基因

1、通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。

2、通过RT-PCR方法:用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA为模板,逆转录形成cDNA第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

(二)构建重组表达载体

1、链霉亲和素,HRP标记(Streptavidin,HRP conjugated)载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

2、PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

(三)  获得含重组表达质粒的表达菌种

1、 将连接产物转化大肠杆菌DH5α,根据重组载体的标志(抗Amp或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。

2、 测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆,重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

3、 以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

(四)诱导表达

1、 链霉亲和素,HRP标记(Streptavidin,HRP conjugated)挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃过夜培养。

2、按1∶50比例稀释过夜菌,一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌0.4-1.0(*0.6,大约需3hr)。

3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组,两组继续37℃震荡培养3hr。

4、分别取菌体1ml, 离心12000g×30s收获沉淀,用100μl 1%SDS重悬,混匀, 70℃10min。

5、离心12000g×1min,取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。

艾美捷Biogradetech链霉亲和素详情：

中文名称：链霉亲和素,HRP标记

英文名字：HRP, Streptavidin

货号：D-AKE21000-100uL

规格：100uL

应用类型：WB/IHC/ELISA

保存建议：自发货之日起，-20°C可稳定保存1年。为最大限度的避免损失，请在打开管盖之前融化抗体并离心。建议使用前分装以避免反复冻融。

链霉亲和素,HRP标记可用于检测生物素分子及生物素标记物质。此产品建议使用浓度:

1. 免疫印迹1:200-500 。

2. 免疫组化:1:200-1000 。

3. Immunocytocehmistry:1:200-1000

4. 酶联免疫吸附试验1:200-2000

https://www.amyjet.com/products/D-AKE21000-100uL.shtml