| 实验步骤 |
第 1 阶段：用于 MOS 和 XmaⅠ消化的 PCR 扩增
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
EDTA,0.2mol/L
矿物油
TN 缓冲液（10 mmol/LTris-HCl、pH7.6，10mmol/LNaCl)
2. 酶和酶缓冲液
PCR 缓冲液，10X(40 mmol/LTricine-KOH、22°C 下 pH9.2,3.5 mmol/L 乙酸镁，10mmol/L 乙酸钾，75 mg/mlBSA，或者厂商提供）
聚合酶混合液，50X(Advantage2，Clontech，或相当产品）
XmaⅠ(10U/ul)
XmaⅠ缓冲液，10X
3. 核酸和寡核苷酸
DNA
dNTP 溶液（包含所有 4 种 dNTP，各 10 mmol/L)
各稀释的第二次杂交样品（来自方案 2 第 17 步）
PCR 引物 P1
PCR 引物 NP2R
PCR 引物 P1
4. 专用设备
热循环仪
水浴，预设为 37°C 和 74°C
5. 附加试剂
琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备
酚：氯仿抽提和乙醇沉淀所需的试剂
二、方法
1. 用于 MOS 的初级 PCR 扩增
(1) 从每个稀释的第二次杂交产物中（来自方案 2 第 17 步）各取 10ul，加到标记好的管子中。
(2) 按照下表，配制用于初级 PCR-1 的主体混合液。这个配方足够做一个反应。根据要按比例扩大。对于每个反应，按照下表将试剂混合。
(3) 混匀，并短暂离心。
(4) 将 115ul 主体混合液分装到第 1 步的反应管中。
(5) 将最终的 125ul 混合液，分装到 5 个 0.5 ml(原文为 ul—译者改）的 PCR 管中(每管 25ul)。
(6) 用 1 滴矿物油覆盖。
(7) 将反应混合液在热循环仪中 74°C 温育 5 min，以延伸接头，然后立即开始以下循环。
(8) 从 5 个初级 PCR-1 产物中，各取 2ul 到一个管中混合，并加 390ulH20。
(9) 从第 8 步稀释的每个初级 PCR-1 产物混合液中，各取 1ul 到一个标记妤的 PC 管中。
(10) 按照下表，配制用于初级 PCR-2 的主体混合液。
(11) 混勻，并短暂离心。
(12) 将 24ul 主体混合液分装到第 9 步的各反应管中。
(13) 用 1 滴矿物油覆盖。
(14) 立即开始以下循环。
(15) 从每个反应产物中，各取 4ul 在 2.0% 琼脂糖凝胶上分析。
2. 用于 MOS 的次级 PCR
(16) 从上面第 14 步产生的每个初级 PCR-2 混合液中，各取 2ul, 用 38ulH20 稀释。
(17) 从每个稀释的初级 PCR-2 产物混合液中，各取 2ul，分装到标记好的管子中。
(18) 按照下表，配制用于次级 PCR 的主体混合液。这个配方足够做一个反应，根据需要按比例扩大。对于每个反应，按照下表将试剂混合。
(19) 混匀，并短暂离心。
(20) 将 48ul 主体混合液分装到第 2 步的反应管中。
(21) 用 1 滴矿物油覆盖。
(22) 立即开始进行 10~12 个循环：95°C 10s，68°C10s,72°C1.5 mm。
(23) 从每个反应产物中各取 4ul 在 2.0% 琼脂糖凝胶上分析。
(24) 用酚/氯仿抽提和乙醇沉淀纯化次级 PCR 产物。
(25) 用 20~40ulTN 缓冲液溶解沉淀，使 DNA 浓度为 20ng/ul
(26) 取 2ul 纯化的 PCR 产物，在 2.0% 琼脂糖/溴化乙锭凝胶上分析。
(27) 用 1.6 mlH20 稀释 14 第 10 步纯化的 PCR 产物（这将作为未消化的对照）。
(28) 反应产物保存在-20°C。
3.XmaI 消化
(29) 在管中加入下列试剂
(30) 混匀，然后在 37°C 温育 2 h。
(31) 加入 2ul 0.2mol/LEDTA，以终止反应。
(32)74°C 温育 5 min, 使酶失活。
(33)-20°C 保存。
第 2 阶段：MOS 杂交
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
稀释缓冲液（20 mmol/LHEPES-HC1、pH8.3,50 mmol/LNaCl 和 0.2 mmol/LEDTA)
4X 杂交缓冲储存液：4mol/LNaCl，200 mmol/LHEPES、pH8.3,4 mmol/L 十六烷
基三乙基溴化铵（CTAB)，最终的 1X 杂交混合液用稀释缓冲液来稀释矿物油
2. 核酸和寡核苷酸
XmaI 消化的 DNA
3. 专用设备
热循环仪
二、方法
1. 在一个 1.5 ml 的离心管中，混合以下试剂。
2. 从混合液中，取 2ul 到一个 0.5 ml 的离心管中，用 1 滴矿物油覆盖。
3. 在热循环仪中 98°C 温育 1.5 min。
4. 在热循环仪中 68°C 温育 3 h。
5. 在管中加 200ul 稀释缓冲液，并吹吸混匀。
6. 在热循环仪中 70°C 加热 7 min。
7.-20°C 保存。
第 3 阶段：MOSPCR 扩增
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
dNTP 溶液（包含所有 4 种 dNTP, 每种为 lOmmol/L)
矿物油
2. 酶和酶缓冲液
PCR 缓冲液，lOX（4Ommol/L Tricine KOH、22°C 下 pH9.2，3.5 mmol/L 乙酸镁，10 mmol/L 乙酸钾，75 mg/mlBSA, 或者厂商提供）
聚合酶混合液，50X(Advantage2,Clontech, 或相当产品）
3. 核酸和寡核苷酸
稀释的 DNA 样品（杂交后的样品及相应的未消化对照，方案 4 第 2 阶段第 6 步和方案 4 第 1 阶段第 26 步）
MOSPCR 引物（NP2Rs)
4. 专用设备
热循环仪
5. 附加试剂
琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备
二、方法
1.按照下表，为所有的 MOSPCR 配制主体混合液。
2.在标记好的含有 24ul 主体混合液的管子中，各加 lul 稀释的 DNA 样品（杂交后样品及相应的未消化对照）。
3.用 1 滴矿物油覆盖。
4.将反应混合液放在热循环仪中，74°C 温育 5 min, 以延伸接头（不要将样品从热循环仪中取出）。
5.立即开始下面的循环。
6.从每个管中，各取 4ul 在琼脂糖凝胶上分析。
7.反应产物保存在-20°C。
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