长期被误解非编码RNA存在“认知黑洞”

　　在人类基因组中95%的基因并不编码蛋白质，其他物种也有大量的非编码基因。这些DNA不会被编码成蛋白质，却又会转录出非编码RNA，它们对生命活动起什么作用？是进化的冗余还是神秘的缓存？

　　 《细胞》杂志近日刊登中国工程院院士曹雪涛团队的研究论文，他们发现一种全新非编码RNA分子。该分子能够调控免疫系统的“进”与“退”，这是此前学术界从未认识和证明的。

　　 “由于长链非编码RNA（lncRNA）丰度低，业界对其功能争议很大。”浙江大学生命科学研究院教授徐平龙在此前接受采访时评价道，但此次发表的研究严谨地鉴定了所发现的一种全新lncRNA是有功能的，即能够进行免疫调控，而曹雪涛院士正是这一机制的主要开拓者之一。

　　 大海捞针 从浩淼细胞中层层筛选而出

　　 细胞虽小，却瀚如乾坤。寻找一个不知道存不存在的RNA分子，如大海捞针。

　　 到哪里找线索？病毒感染给了曹雪涛启示。谈到为什么会从病毒这个“敌人”的角度考虑。曹雪涛讲道：“我们中国文化讲，阴中有阳、阳中有阴，这是外国人很难理解的。这一哲理指导我们对免疫系统的理解就是，激活和抑制很可能会交融在一处，那么我们就从这个‘交融点’突破解题。”

　　 既然体内蛋白能够识别外来的病毒RNA，能不能识别体内自身RNA呢？

　　 科学界大部分认为不能。“免疫系统拥有识别‘自我’‘非我’的能力，就好像边境卫士，对外来的侵害反应敏感，对辖内‘居民’熟视无睹。”曹雪涛院士团队成员之一、中国医学科学院基础医学研究所教授姜明红说，“但是曹老师并不这么看，他说，究竟是不是熟视无睹，你要证明才行。”

　　 在中国传统哲理思想的指引下，曹雪涛锁定了一个已知的关键蛋白——“RIG-I”，求证这个能与病毒RNA结合的蛋白，会不会和体内自身的RNA分子结合。

　　 RIG-I很像一个分子水平的“老鼠夹子”，2011年有科学家解析了这个蛋白的分子结构，发现“老鼠（病毒RNA）”没来的时候，夹子合着，两头的结构域相互作用，蛋白处于“闭合”状态；一旦“老鼠”来了，与夹子的一头结合，另一头就会“弹开”，蛋白遂处于激活状态。而这样的构象变化，会引发细胞合成出关键的抗病毒分子——干扰素，干扰素分泌后被周围细胞接受，引发抗病毒的“连锁反应”。

　　 研究团队通过紫外加强RNA结合蛋白免疫沉淀（UV-RIP）的方法，将“老鼠夹子”和它猎捕的“老鼠”同时从细胞中分离出来。随后通过蛋白质变性等方法，把“老鼠夹子”过滤掉，就获得与RIG-I结合的所有RNA。

　　 夹子“钓”上来的所有RNA中，有没有未被发现的有功能的lncRNA呢？

　　 将“捞针”的范围锁定夹子“钓”上来的RNA后，团队又通过设计对应的干扰实验继续缩小范围，即看究竟哪个RNA被封杀之后，免疫活动不再被抑制。功能筛选帮助团队锁定了一批备选者并列出“排名”。排名靠前的RNA分子，且与特定信号通路相关的lnc-Lsm3b被锁定，一个新的RNA分子从浩淼的小鼠巨噬细胞中经过层层筛选被“打捞”上来，并获得了确切的序列。

　　 团队后续开展了多角度的证明工作，如通过干扰、敲除、过度表达等技术，反复证明lnc-Lsm3b能够在病毒感染的细胞中，通过“分子诱饵”的方式锁定RIG-I，使其不与病毒RNA结合。

　　 海量实验 顶级期刊的尖锐难题被逐个攻克

　　 全新的发现，使得团队兴奋异常。没想到的是，更大的磨砺还在后面。

　　 团队向顶级期刊投稿，审稿人却要求必须用CLIP（交叉互连免疫沉淀）技术明确RNA的哪一个点和蛋白质相互作用，连接在一起。用语言很难解释蛋白质和RNA在活体细胞内错综复杂的关联，姜明红给科技日报记者画图：一个长链RNA会结合多个蛋白，这些蛋白有的是特异连接，连得紧密，有的就是“挂”在上面，而蛋白之外还会带上其他的RNA，“缠绕”“连带”“虚实”……

　　 CLIP很难做，国内实验室极少有成熟的经验。收到修改意见后的团队成员开始大量查阅论文。“国外的实验流程无法完全照搬，不同的细胞做法不同，需要重新摸条件。”团队中主要攻关这一技术的刘伦说。

　　 CLIP技术和RIP（RNA结合蛋白免疫沉淀）技术类似，但是却能够达到单个碱基的分辨率。为此，通过海量实验，针对裂解液的成分如何影响细胞内物质，团队开始了如指掌；不同RNA酶的脾气也熟练掌握。

　　 “实验室的部分我们自己攻克了，但是测序公司表示无法进行匹配的测序工作，原因是无法合成特有的适当引物。”刘伦说，国内没有公司生产CLIP所需引物，而RNA测序必须先反转录为cDNA才能够进行，引物决定了反转录的准确性，决定了目标位点能否确定。实验室自己担负起RNA转录、构建cDNA文库的工作。完成3代测序、用化学方法测量分子间的相互作用力……这些免疫研究实验室原本并不擅长的难题被团队逐个攻克。

　　 按图索骥 摸索并掌握一套独有技术体系

　　 根据已有发现，团队按图索骥，利用分子筛层析实验证实缺失lnc-Lsm3b表达的巨噬细胞在感染病毒以后，多聚化的RIG-I蛋白显著增加。他们推测，病毒RNA与RIG-I结合以后，能够诱导RIG-I单体形成多聚化状态，从而激活下游信号通路。而lnc-Lsm3b只与单体结合，可能是通过抑制RIG-I的多聚形成抑制RIG-I的活性。

　　 “Lsm3b只能结合单体的RIG-I蛋白、一条链能结合9个蛋白、结合力比病毒RNA高……”这些都是对这个全新RNA分子的多角度了解。

　　 如同向“黑洞”中打进一束光，曹雪涛团队在对现有知识体系颠覆的同时，肯定地回答了学界之前关于这类自身RNA分子是否存在、功能几何的争议。

　　 “过去我们用别人的技术进行实验，现在我们自己摸索并掌握一套独有的技术。”曹雪涛说，整个研究的“练兵”不仅拓展了人类的“知识域”，还拓展了实验室的思路和眼界。接到《细胞》杂志编辑部发来修改要求时感受到的“不可思议”和巨大压力，团队成员现在已能笑谈。

　　 “只是这段RNA与人类的同源性很低。”姜明红表示了小小的惋惜，这意味着，该发现无法直接应用于人类的新药创制领域，但是，其他拥有人源细胞材料的机构，可以沿着这条路，进一步发现人类机体内是否存在相似的RNA。曹雪涛更看重的是，确定靶点的方法一旦被高质量地掌握，就能够确定蛋白质的靶点，进而确定药物作用的靶点，助力抗病毒药物的研发。