间接原位PCR（原位杂交PCR）实验

实验材料 组织或细胞样品

试剂、试剂盒 SSC硫酸葡聚糖甲酰胺脱脂奶粉Denhardt’s 液SDS变性的鲑鱼精DNARnaseDTT乙醇

仪器、耗材 玻片石蜡膜橡皮泥湿盒

实验步骤

一、预杂交

1.   试剂与配制

2×SSC

50%去离子甲酰胺：用4×SSC配制（v/v）

预杂交液：2×SSC，5%硫酸葡聚糖，50%甲酰胺，0.2%脱脂奶粉

2.   操作方法

（1）在进行完原位PCR扩增后，用2×SSC预浸经乙醇脱水、空气干燥的玻片，并简洗15 min；

（2） 用50%去离子甲酰胺37℃孵育15 min；

（3）加预杂交液20 μl/片，在杂交温度下孵育30 min～2 h。

二、杂交

1.  试剂与配制

杂交液：50%去离子甲酰胺，5×SSC，10%硫酸葡聚糖，5×Denhardt’s 液，2%SDS，10 mg/ml变性的鲑鱼精DNA

2.  操作方法

（1）弃预杂交液，加杂交液（含0.2～5 μg/ml探针）10～20 μl/片，覆盖经硅化的盖玻片，石蜡膜封片或橡皮泥封片；

（2）玻片置于湿盒中，42℃杂交12～18 h（过夜，但不能超过24 h）。

三、杂交后处理

1.  试剂与配制

2×SSC

Rnase（20 μg/ml）

50%去离子甲酰胺

10 mmol/L DTT

2.   操作方法

1.   杂交完毕，用2×SSC浸泡玻片数分钟，轻轻移去盖玻片，再用2×SSC洗玻片1～2 min；

2.   2×SSC（含20μg/ml RNase，适宜RNA探针，DNA探针可省略此步）中洗片30 min，37℃；

3.   2×SSC/50%去离子甲酰胺，42℃×10 min；

4.  1×SSC/50%去离子甲酰胺，37℃×30 min，2次；

5.   4×SSC/10 mmol/L DTT洗1 h；

6.   0.1×SSC洗2次，每次37℃×30 min；

7.   PBS中洗10 min，即可进行显色，方法同上。

注意事项

1.  如果检测mRNA，双链探针应变性处理，方法是95～100℃加热10 min后迅速置于冰中骤冷；

2.   以单链探针检测DNA时，DNA也需变性处理，将玻片置于70～80℃变性液（70%去离子甲酰胺，即甲酰胺/2×SSC，v/v）中10 min；

3.   用双链探针检测DNA时，可按上述方法变性处理。