限制性内切核酸酶的作用是在限制位点切割质粒分子自连接产生的环状和线性多联体。该方法需要质粒与靶DNA分子的连接破坏限制性酶切位点，以防止限制性内切核酸酶消化连接反应过程中产生的重组体。
单位长度线性载体分子持续再生的净效应，推动连接反应的平衡状态强烈偏向于载体和插入物之间形成重组体。
因为载体DNA的再生、连接、所有PCR产生的DNA片段的末端补平都同时发生在同一反应混合物中，该方法非常高效。
14 DNA理按酶3U调整H2O的加入量，使最终的反应体积为20μL°设置对照反应，包含.上述列出的所有试剂，除了扩增的靶DNA。
2.在22'C孵育连接混合物4h。限制性内切核酸酶切割质粒DNA:在dNTP的存在下，T4 DNA聚合酶的3外切核酸酶活性补平扩增的DNA的末端。
3.分别用10μL@ H2O稀释5μL°两种连接混合物，转化合适的抗生素抗性的感受态大肠杆菌菌株(见信息栏“抗生素”)。根据载体和宿主基因型、IPTG 和X-Gal,将转化培养物铺在含有适当抗生素的培养基上(见第1章中信息栏“X-Gal”和方案14的信息栏“IPTG")。
4.计算从每个连接混合物得到的菌落数量。如果质粒可用于蓝/白筛选，挑选- -些用含有靶DNA的连接反应产物转化得到的白色菌落。在不同的实验中，蓝色：白色菌落的比率可以在1:5 到2:1之间变化。
5.通过分离重组质粒DNA，并用适当的限制性内切核酸酶消化确认扩增片段的存在。