陈玉林教授团队新技术流程用于创制基因编辑绵羊模型

　　近年来，以基因编辑技术为代表的家畜分⼦设计育种技术迅速发展。CRISPR/Cas9基因编辑技术是具有简单、高效、精确等优点的新型基因编辑⼯具，将其应用于家畜育种，有望对多个基因实现同步的精准编辑，提高家畜选育的精准度，缩短育种周期，加快育种进程。绵羊是重要的经济动物，更是基因编辑的模式动物，研究绵羊的基因编辑对动物生产性能的改良、生物医学和生物制药的研究具有重要的意义。

　　西北农林科技大学陈玉林教授团队采用CRISPR/Cas9系统创制了编辑不同基因的绵羊群体，针对不同基因的相关性状展开了研究。其中相关技术的完整实验流程以Multiplex Gene Editing viaCRISPR/Cas9 System in Sheep（www.bio-protocol.org/e2385）为题整理发表在Bio-Protocol杂志，供研究人员参考和应用。

　　CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/ CRISPR associated protein 9）介导的基因编辑技术是当今研究基因功能的重要手段之一，研究人员利用该系统在不同物种上揭示了许多重要基因的生物学功能。CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌内通过RNA介导的特异性切割外源遗传物质的获得性免疫系统。II型CRISPR/Cas系统即CRISPR/Cas9已经被证明可以在试管中高效切割任意给定的DNA。CRISPR/Cas9与传统的ZFN和TALEN技术相比具有效率高、序列选择限制小（只需要基因组上出现GG即可）、易实现多位点打靶、构建过程相对简单等优点。

　　在这项实验中，研究人员选取了具有抑制肌肉发育功能的肌肉生长抑制素（Myostatin，MSTN）基因、影响脂肪颜色的β -胡萝卜素双脱氧加氢酶（β-carotene-9',10'-dioxygenase，BCO2）基因和影响毛色的刺鼠信号蛋白（Agouti Signal Protein，ASIP）基因作为目标基因。设计相应的sgRNA，经过细胞水平编辑效率检测后选择最优的sgRNA作为CRISPR/Cas9系统的向导RNA注射入滩羊（宁夏绵羊）受精卵细胞质中，经体外培养后移植入雌性滩羊输卵管中，用于生产同时敲除MSTN、ASIP、BCO2基因的基因编辑滩羊，最终共获得羔羊54只（活羔36只）。其中，MSTN基因编辑阳性羊 27.8%（10/36），ASIP基因编辑阳性羊 33.3%（12/36），BCO2基因编辑阳性羊27.8%（10/36）。随后，试验人员采取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮肤、肌肉、睾丸或卵巢的组织样品，进行PCR 扩增、T7E1酶切和Sanger测序分析，证明了Cas9介导的基因编辑存在于内、中、外三个胚层。同时团队成员对基因编辑阳性羊的生殖细胞进行检测，充分证明了基因编辑个体可以稳定地将突变遗传给后代。另外，该团队持续监测了MSTN阳性羊和野生型羊从出生至 240天的体重情况，MSTN阳性滩羊的体重均显著高于野生型羊，且阳性羊的肌纤维直径更宽、肌纤维横截面积更大，表明MSTN基因突变造成基因编辑绵羊肌肉发育能力的提高。值得提及的是，团队成员对基因编辑羊进行了家系全基因组测序，全面分析了基因编辑羊基因组上的新发突发、插入或缺失和结构变异的数据；除发现一个2.4kb DNA倒置（发生在MSTN的两个sgRNA靶向位点之间一个低发病率的基因座上）外，其它脱靶突变影响几乎可以忽略不计。他们同时利用家系数据系统的筛查了基因编辑山羊后代中新发突变的发生情况，发现基因编辑动物及其后代中的新发突变频率与对应的自然群体（绵羊、山羊）和其他物种（人、牛等）无异。该结果表明基因编辑技术并未在全基因组上引入更多的潜在突变，初步证明了该技术的安全性及可用于动植物育种和生物医学研究。