青岛能源所实现反式乌头酸高效绿色生物制造

　　反式乌头酸（trans-aconitic acid）是具有三个羧基和一个不饱和双键的C6小分子有机酸，在农业线虫病害防治方面具有较好的效果，颇具应用前景。反式乌头酸传统上主要是通过从甘蔗制糖过程中少量提取获得，而开发的化学合成方法过程复杂、副产物多、得率低，均无法实现大规模低成本生产，使得反式乌头酸未能形成大规模商业供应。原料可及性问题成为阻碍反式乌头酸下游应用开发的关键限制性因素。

　　中国科学院青岛生物能源与过程研究所微生物制造工程中心设计构建了高效合成反式乌头酸的微生物细胞工厂，联合相关单位开发了发酵工艺并完成工程放大验证，实现了反式乌头酸的高效绿色生物制造，解决了关键的原料可及性困境，同时通过田间实验证明反式乌头酸可有效降低农业根结线虫的危害。近日，相关研究成果发表在《代谢工程》（Metabolic Engineering）（图1）上。

　　该工作选择具有低pH耐受能力的产衣康酸土曲霉工业菌株作为底盘细胞，通过敲除顺乌头酸脱羧酶编码基因阻断衣康酸的生物合成，构建同时大量积累顺乌头酸和反式乌头酸的第一代土曲霉工程菌株，总产量约10 g/L。该工作为了将顺乌头酸快速转化为反式乌头酸以避免进入TCA循环被消耗，筛选评估不同时间响应的强启动子、不同定向整合位点、不同底盘细胞和不同乌头酸异构酶元件，设计了异源重构乌头酸异构化模块的系列土曲霉菌株，获得了更高效的第二代产反式乌头酸细胞工厂，摇瓶发酵产量约20 g/L，反式乌头酸比例从57%提高到90%（图2）。

　　进一步，科研人员在培养基优化过程中通过多组分筛选发现反式乌头酸发酵生产过程中的关键营养限制因子，并通过溶氧控制等条件优化开发了百升罐的发酵工艺，依托相关单位的产业化中试平台将工艺逐步放大优化到5吨罐，并完成20吨发酵规模的生产示范，发酵98小时反式乌头酸产量达到60 g/L（图3）。

　　植物寄生线虫是造成农业经济损失的农业病虫害，且防治手段有限。有关单位基于发酵生产的反式乌头酸开展了黄瓜线虫防治田间试验。结果显示使用反式乌头酸后根结线虫病造成的危害得到有效改善。反式乌头酸560g亩用量与当下主流化学杀线剂噻唑膦180g亩用量的防治效果相当，但使用成本显著低于噻唑膦（图4）。该工作为植物寄生线虫防控这一难题提供了新的解决方案。

　　该工作利用合成生物学策略开发了可实现反式乌头酸大规模低成本生产的绿色生物制造技术，为反式乌头酸杀线剂的开发奠定了基础。更重要的是，反式乌头酸原料可及性困境的突破，将推动反式乌头酸作为重要生物基化学品的下游应用技术开发、为生物基材料开发提供了新选项。

　　研究工作得到国家重点研发计划、中国科学院战略性先导科技专项（A类）、国家自然科学基金和山东省人才计划的支持。