非放射性标记探针的双重标记原位杂交

    如果用不同的标记物标记不同的核酸探针，只要互相不影响各自的杂交反应，检测系统也不相互干扰，杂交信号易于分辨，原则上均能用于双重或多重标记原位杂交。应用非放射性标记探针的双重标记原位杂交。可克服放射性核素标记探针的分辨率低、时间长以及放射性污染等缺点。

    1．应用生物素标记探针的双重标记原位杂交  应用生物素分别标记的两种探针进行双重标记原位杂交时，杂交反应可用含两种标记探针的杂交液一次进行。因为生物素标记探针可用辣根过氧化物酶标记的亲和素检测(以3―氨基―9―乙基―卡巴唑为底物，阳性反应产物为红色)，而标记的探针用碱性磷酸酶标记的抗体来检测(反应产物为蓝色)，两个检测系统互相无干扰，所以，标记的亲和素抗体也可混合在一起一次孵育。但两种酶的呈色反应需要的pH条件相同，故呈色反应需分先后两次进行。

    2．双重荧光标记原位杂交  利用具有不同颜色的荧光素分别标记不同的核酸探针，可检测同一组织或细胞内两种不同的靶核酸。用不同的荧光素作标记物进行双重标记原位杂交，有直接法和间接法两种。直接法将具有不同颜色的两种荧光素分别标记两种不同的核酸探针，用其做原位杂交，杂交信号能在荧光显微镜下通过选择不同的激发滤片而直接观察。此法操作简便，但敏感性不高。间接法用生物素分别标记两种不同的核酸探针，然后用不同荧光素标记的亲和素(或抗生物素抗体)抗体来检测杂交体。间接法比直接法敏感性更高。