非标记抗体免疫电镜技术

一、原理

标记抗体法虽然具有许多优点，但也存在一些难以克服的问题，如标记抗体的分子增大，对细胞膜和组织的穿透力减弱；化学交联反应对抗体和酶的活性有所影响；结合物中未标记的抗体可与抗原竞争结合，影响检测方法的敏感性等。不标记抗体法可以避免上述的不利影响因素，通过一系统的非标记抗体的免疫学反应，对组织中的抗原进行定位检测。不标记抗体法又可分为用标记物显示和不同标记物显示两种方法。前者利用基因工程方法制备双特异性抗体的F(ab′)2，一个Fab片段与标本中的抗原结合，一个Fab是抗体蛋白的结合片段。在抗体与标本作用后，再加入铁蛋白与抗体结合，从而显示组织内抗原的所在部位。后者则用磷酸钨负染后，直接电镜观察。

二、材料及试剂

1．待检病毒材料  如粪便，气管分泌物、脑脊髓液、组织培养液等。

2．高速离心机

3．已知抗体

4．磷钨酸

5．琼脂糖

6．其它

三、操作方法

1．经典法

① 将被检病毒材料0.9ml，加1︰5～1︰10稀释的特异性免疫血清0.1ml充分混合。

② 置37℃作用1h或37℃1h后再置4℃过夜。

③ 以17 000r/min～23 000r/min离心90min。

④ 吸去上清，将离心管口倒置于滤纸上，吸去残留液体。

⑤ 沉淀物中加少量H₂O混悬，用3%磷钨酸(pH6.0)负染20Sec～30Sec，滴加于400目铜网Fomnvar膜上，用滤纸从铜网边缘轻轻吸去多余的负染液。

⑥ 在透射电镜下4×10⁴倍观察。

2．快速法(琼脂扩散法)

① 制备免疫复合物。

② 以生理盐水或pH 7.2巴比妥缓冲液制备1%琼脂糖，趁热浇注于洁净的载玻片上，每片3ml，待冷却凝固后，在凝胶面上等距离放置直径4mm玻璃珠数粒，再于凝胶面上浇注1%琼脂糖2ml～3ml，冷却凝固后，取出玻璃珠，使凝胶形成凹孔。

③ 将普通滤纸剪成2×3cm大小，3～4层重叠。用小刀将带有凹孔的琼脂糖切成小块,每块带有一个凹孔,平放在滤纸上。

④ 在凹孔内，加入制备好的含病毒的免疫复合物悬液。

⑤ 将电镜载网的Fomnvar膜面向下倒悬于液滴上。由于琼脂糖的吸水作用，20min～30min后，可将液滴的水分吸干，而浓缩的免疫复合物则粘附在载网膜上。

⑥ 在载网膜上滴加3%磷钨酸负染20Sec，过量的负染液用滤纸在载网边缘轻轻吸去。

⑦ 于透射电镜4×10⁴倍下观察。

四、结果判定

直接观察病毒粒子的形态。由于离心浓缩的处理和特异性抗体的加入，大大提高了观察的敏感性。