非标记蛋白质的磷酸化作用分析实验

蛋白质样品

钒酸钠 封阻液 TN TNA Tris·Cl 叠氮钠 印度墨汁染色液 TBS

吸水纸 水浴锅

1.  用等体积的2×SDS上样缓冲液溶解培养细胞，组织或裂解物，煮沸5 min。

2.  在SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳样品，用含100 μmol/l 钒酸钠的转移缓冲液将蛋白质转移至适用于免疫印迹分析的膜上。

3.  膜在室温下用30~50 ml 封阻液封闭30 min 以上。

4.  在带盖的塑料容器内，膜与30~50 ml 抗磷酸酪氨酸抗体溶液室温温育60~120 min，间或摇动。

5.  取出膜，用吸水纸吸干多余液体，在一个新的塑料容器内，用TBSA溶液洗膜 2次，每次10 min；50 ml NP-40洗膜液洗膜2次，每次10 min；再用50 ml TBSA洗膜2次，每次5 min，弃洗液。

6.  用30~50 ml 含0.5 μCi/ml ¹²⁵I 标记蛋白A与膜在室温下温育60 min，间或摇动。

7.  移出膜，用吸水纸吸干多余液体，同步骤5洗膜。 

8.  如果需要，用30~50 ml 墨汁染色液染膜5~10 min，直到有可见蛋白带，充分洗膜除掉多余的墨计。

9.  用吸水纸吸干多余液体，用塑料包装膜包好，加上放射性或荧光的位置标记后，用经预闪光致敏的X光片和增感屏，自显影18 h至10天。