非洲粟酒裂殖酵母的转化实验

细胞

腺嘌呤 亮氨酸 LiAc

YEA 平板

1. 在 YEA 平板上培养细胞直到长成可见单菌落。

2. 接种单菌落到添加有 150 mg/L 腺嘌呤、亮氨酸和/或尿嘧啶等营养缺陷互补物的 YEA 或 PM 培养基中，于允许温度以 200 r/min 振荡培养防止酵母菌沉积，使细胞滴度达到每毫升 5X10⁶ 到 1X10⁷ 个细胞。

3. 1000~2000 g 离心 5 分钟，用灭菌蒸馏水洗一遍。

4. 用过滤除菌的 0.1 mol/L CH₃COOLi，pH 4.9 洗一遍。

5. 重悬于 0.1 mol/L 的 LiAc 使细胞滴度为每毫升 10⁹ 个细胞，取 100 μl 等份转移到微量离心管中，在允许温度孵育 60 分钟。

6. 加 1 μg 溶于 15 μl TE 中的质粒 DNA，轻轻旋转混匀，于允许温度孵育 60 分钟。

7. 加 290 μl 预热到允许温度的 50% PEG3350，轻轻旋转混匀。于允许温度孵育 60 分钟。

8. 于 42℃ 热休克 15 分钟，允许温度下使细胞恢复 10 分钟。9000 r/min 离心 2 分钟沉淀细胞。

9. 用 1 ml 非选择性基本培养基重悬细胞，转移到 10 ml 非选择性基本培养基中。于允许温度孵育 30 分钟，剧烈振荡以保持细胞的悬浮状态。然后置于室温不摇孵育 30~90 分钟。

10. 2000~4000 g 离心 10 分钟沉淀细胞，重悬于合适体积的选择性基本培养基中涂板，平板为 PM。