靶向测序：表达谱分析的新选择

　　没有人愿意听到“癌症”这个词。不过在提到前列腺癌时，人们的情绪往往更加复杂：有些人的肿瘤不会扩散，需要积极监控；而有些人就没那么幸运，需要手术或放疗和化疗。医生所面临的挑战是正确的诊断，再加上适当的治疗。

　　Carlos S.Moreno是埃默里大学温希普癌症研究所（Winship Cancer Institute）的副教授。他和他的同事决定寻找生物标志物，来帮助分类。他们选择的分析是RNA测序（RNA-seq）。研究小组从106个前列腺样本中提取RNA，去除核糖体RNA，合成cDNA并制备测序文库。在分析了大量碱基之后，研究小组发现了与肿瘤进展密切相关的基因表达特征。

　　“我们确定了一组共24个基因，能非常准确地判定手术后会复发的患者，”Moreno谈道。“它比一些市售的分析集合更好，而且它有望检测侵袭性的前列腺癌。”

　　当研究人员寻找生物标志物，但又不知去哪里寻找时，这种策略很有意义。不过，全转录组的RNA-seq实验从资金和计算角度来看都是昂贵的，于是研究人员改为关注转录组的一小部分，以降低复杂性。

　　长短结合

　　与芯片和qPCR的方法不同，NGS是“无偏向的”，它不需要研究人员提前知道它们要找什么。它显示了每条序列有多少分子存在，以及转录本结构和序列变异的细节。不过，这都取决于实验如何运行。

　　Illumina的测序仪将长的DNA打断成数千万甚至上亿个片段，每个的长度为几百个碱基。它的测序深度意味着研究人员通常可以识别罕见的序列，但这也让转录本的组装很复杂，也就是说，弄清楚哪些外显子是在同一条转录本上。

　　Pacific Biosciences产生的读取更长，但较少，每四小时的运行大约产生75,000条读取，读长平均为10,000bp。这让研究人员能够从头到尾地读取转录本，这在鉴定新颖的转录本异构体时特别有用。

　　考虑到这两种方法的优势互补，许多研究人员在转录组分析时综合了PacBio和Illumina的方法。

　　麻烦的是，NGS的好处是随测序深度而增加。因此，尽管RNA-seq能检测到新颖的转录本和异构体，“但实际上，大多数人都不会测得那么深，”Affymetrix表达业务部的首席科学家Anthony Schweitzer说。为了平衡预算和规模，研究人员往往在每个测序通道中挤进多个样品，降低每个样品的成本及测序深度。高丰度的转录本会大量占用测序读取，导致罕见的转录本可能永远都看不到。

　　2014年9月，测序质量控制（SEQC）项目发表了RNA-seq测序性能的跨平台分析结果。2他们利用Illumina、Life Technologies和罗氏的测序技术，在10个实验室中测序了两个参考RNA样本。之后，他们将超过10Tb的数据与芯片和qPCR的数据集进行比较。

　　研究小组发现，全面捕获人类转录组的丰富性相当难。据Illumina的产品营销主管KevinMeldrum介绍，对于表达谱分析，Illumina建议获得1000万条读取，而发现性的工作需要5000万条读取。然而，SEQC研究人员甚至在10亿条读取中仍检测已知的转录本。

　　新型策略

　　靶向测序让研究人员能够最大限度利用他们的测序运行，将精力集中在那些感兴趣的序列上。例如，Moreno正在测试一种109个基因的集合，其中包括他之前鉴定出的24个基因。为了获得那些数据，Moreno利用Cellular Research的Precise™MolecularIndexing分析，来捕获样本中的目标序列。

　　Precise分析让研究人员能够在cDNA合成和扩增过程中引入6500条独特的序列条形码，以克服扩增偏向，并准确估计转录本的丰度。通过计算条形码，而不是读取，研究人员能够确定每条转录本有多少个拷贝。Cellular Research的销售经理Martin Pieprzyk解释：“这就像一张电影票。即使我复制10份，你也知道它们是副本，因为每个都有唯一的编号。”

　　Moreno表示，他之所以选择Precise方法，是因为这种分析能处理极少量的RNA，这是exosome研究的一个关键因素。此外，这项技术也能降低实验成本。“由于只测序少数基因，那么你可以在单个通道中对多个患者的样本进行多重分析，”他说。据他估计，成本会降低一个数量级，甚至更多。

　　其他公司也推出了替代的靶定策略。Illumina有TruSeq TargetedRNA Expression试剂盒，覆盖p53和Wnt等信号通路，也能添加12-1000个基因的定制分析。据Meldrum介绍，此试剂盒与MiSeq和Next Seq 500测序仪兼容，是基于靶向序列的PCR扩增。

　　罗氏Nimble Gen也提供四种Seq Cap RNA试剂盒：富集长链非编码RNA的预设计试剂盒，以及捕获多达100Mb人类序列目标或200Mb非人类或非传统转录组的定制试剂盒。

　　传统方案

　　当然，研究人员也可以利用传统的PCR来靶定。在最近一项研究中，瑞典乌普萨拉大学的研究人员利用这种方法来寻找慢性髓性白血病（CML）中的BCR-ABL1突变。研究小组从6名CML患者的血液或骨髓样本中扩增出1.6kb的BCR-ABL1cDNA，并在Pac Bio系统上测序，产生约32,000条读取。3

　　研究小组能够发现Sanger测序错过的突变，并区分同一转录本上的突变。他们还发现新的转录本异构体。“这很惊人，因为基因融合的发现已经有20年了，”PacBio的首席科学家Jonas Korlach指出。“你觉得一切都是已知的，但有了新的技术，我们看到了新的东西。”