颠覆传统观点，逆转疾病：Nature公布CRISPR重要成果

　　在人体和小鼠体内，如果Tmc1-a出现异常，那么内耳中负责感应声波振动的关键细胞：毛细胞（hair cells）就会受损，从而造成耳聋。来自哈佛大学的一组研究人员利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术，剔除了该基因的突变拷贝，从而减少了小鼠听力损失。这一研究成果公布在12月20日的Nature杂志上。

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　　领导这一研究的是哈佛大学化学生物学家David Liu，作为纳斯达克CRISPR“第一股”Editas公司的联合创始人之一，David R. Liu也是最早着手于CRISPR科研的几位科学家之一，据称这位教授是一位从来没有做过博士后的年轻教授，他早年毕业于哈佛大学，1999年在加州大学伯克利校区攻读博士学位，在Peter Schultz教授指导下从事核糖核酸研究，并自主首次开始活细胞遗传密码的研究。之后就被哈佛大学任命为助教授，2004年晋升为教授。Liu教授曾被麻省理工学院技术评论列入全球Top 100 青年发明家（35岁以下），“大众科学”亦将其列入全美Top10最具才气的青年科学家。

　　对于这项最新成果，Liu表示，“这一领域的传统思维是，一旦你失去了内耳毛细胞，就很难再让它们回来了”，“我认为，当可以实现时，基因组编辑药物的瞬时传输性质特别有前途。像是眼睛和耳朵这样可通过局部注射进入的器官组织，这种局部RNP传输确实具有一些真正的优势。”

　　来自俄勒冈健康与科学大学的感官生物学家Peter Barr-Gillespie（未参与该项研究）认为“这是一项非常重要的工作。研究表明，CRISPR介导的基因编辑可以真正改善体内的听力损伤。”

　　TCM1基因突变

　　耳朵是一种复杂的机器，可将机械声波转换成大脑处理的电信号。当声波进入耳朵后，内耳毛细胞不均匀的两端（纤毛）被推回，就像被大风压弯的一棵草。这一活动会引起连接静纤毛的成串蛋白质（纤毛尖端细丝连接蛋白）产生张力，并通过贯穿毛细胞束末端的离子通道，向大脑发出一种信号。人体内耳聋最常见的原因是内耳毛细胞受到损伤，当毛细胞受损，耳蜗螺旋神经节神经元就会开始退化，无法行使功能。细胞移植可以替代毛细胞工作，但如果感觉神经元被损伤，那么听觉仍然是有限的。

　　很早之前，科学家们就知道TCM1基因突变可导致耳聋，并在之前的研究中，他们逐渐发现其编码的蛋白质TMIE，与静纤毛尖端细丝连接蛋白质能相互作用，并将纤毛尖端连接与离子通道附近的一个组件联系起来，也就是说TMIE在纤毛尖端细丝连接和离子通道之间发挥桥接的作用，如果没有TMIE，毛细胞在刺激后就不会诱发电信号。TCM1发生了一种显性负性错义突变后，会导致内耳毛细胞单通道电流水平和钙渗透率降低，进一步导致感音神经性语后聋（语言形成后出现耳聋）。通常，TCM1显性突变患者在10-15岁时会开始逐渐变聋。

　　CRISPR基因编辑介入：不同的传递方式

　　在最新这项研究中，研究人员设计了一种特殊的小鼠模型：贝多芬小鼠模型，之所以起名为贝多芬，当然是来自于这位耳聋的杰出音乐家（虽然贝多芬耳聋的原因并不是基因突变）。在这种小鼠中同样存在引发人体耳聋的TMC1基因突变，小鼠逐渐失去了一些听力，并且由于毛细胞的死亡，到八周时它们完全失聪了。

　　David Liu及其同事设计了一个导向RNA，靶向致病基因拷贝（常染色体显性遗传基因），从而健康的那个等位基因能发挥功能。不过这项研究并没有像常规一样采用基于病毒的系统，传递Cas9和导向RNA序列，研究人员选择利用脂质包裹和传递Cas9指导RNA核糖核苷酸蛋白（RNP）复合物。这一策略改善了突变等位基因的编辑选择性，使其在小鼠成纤维细胞培养物中的靶向性比野生型等位基因多出了20倍。

　　接下来，他们将脂质RNP复合物注入新生的贝多芬小鼠一只内耳中，这个小鼠具有一个贝多芬等位基因和一个野生型等位基因，研究人员也留下一边耳朵未注射，作为内部对照。注射后的耳朵出现了完整的健康毛细胞，但未治疗的耳朵在八周内出现了快速的毛细胞死亡。

　　“这令人兴奋，”Liu说，“因为这表明比较于未治疗耳朵，我们保证了了毛细胞的健康和丰度。”

野生型小鼠的耳蜗（右图），携带一个常染色体显性贝多芬等位基因拷贝的小鼠的未经治疗的耳朵（左图）和经治疗的耳朵（中图）。未经治疗的耳朵中内耳毛细胞（IHC）和外毛细胞（OHC）（绿色）缺失，粉红色数字表示每个段检测到的近似频率（以kHz为单位）。

　　研究人员通过监测听觉脑干反应（ABR）（一种对声音的神经反应的测量）来测试四周龄小鼠的听力。未经治疗的耳朵记录了75到80分贝左右的ABR，与噪音处理量相当。经过治疗的耳朵可以听到安静的约60分贝的声音，相当于一个安静的谈话。野生型小鼠可以听到低至30至40分贝的声音，这表明基因组编辑能部分避免听力损失。治疗八周后，治疗组的ABR阈值仍低于未治疗组，但此时的ABR要高于四周时的情况，这说明小鼠的听力还是出现了变化。

　　Barr-Gillespie表示：“野生型小鼠的阈值远远不够，但是10-15分贝对人体来说是一个巨大的变化。这种听力损失在人体内是非常明显的，治疗可以使生活质量得到实质性的改善。”

　　比利时列日大学的神经科学家Brigitte Malgrange说，“这对治疗遗传性耳聋来说，确实是一个非常重要的结果。目前还只是在小鼠阶段，因此下一步就需要在人体中进行尝试。”

　　约翰霍普金斯医学院的神经科学家UlrichMülle（未参与该项研究）警告道：“问题在于这项技术的适用范围有多大”。他解释说，许多遗传性耳聋早在人胎儿发育期间就会出现，因此这对这种基因组编辑的传递策略更具挑战性。但是，相比于依靠持续性病毒感染的输送策略，这种RNP传输方法减少了脱靶效应，这也许会是一个很好的选择。