首次在康复病人体内分离获得人源CCHFV单克隆抗体

　　2018年，世卫组织将包括埃博拉病毒、马尔堡病毒、MERS、SARS在内的10种病毒病列为优先考虑的传染性病原，其中也包括克里米亚-刚果出血热病毒（Crimean-Congo haemorrhagic fever virus，CCHFV）。

　　CCHFV是一类由蜱虫传播的可以引起严重出血热症状的烈性病毒，感染致死率通常在5%-30%，但在某些暴发波次甚至高达80%，需要在生物安全4级实验室中操作。CCHFV隶属布尼亚病毒目（Bunyavirales）下的内罗病毒科（Nairoviridae），是一类分节段的负链RNA病毒。CCHFV通常由携带病毒的璃眼蜱属（Hyalomma）叮咬传播或接触被病毒污染的家畜而感染，也曾有院内感染的报道。该病毒已经波及欧亚非多国并形成本地流行，成为传播范围最广的蜱传病毒。目前尚无特效治疗药物。

　　CCHFV的基因组分成三个节段（S、L、M），分别编码核蛋白、糖蛋白前体及RNA依赖的RNA聚合酶。依照M节段序列的系统发育关系，CCHFV分为七个分支（clade I-VII）。糖蛋白前体经转录翻译加工，生成病毒囊膜表面的两种结构蛋白Gn和Gc，及三种分泌型蛋白（GP38、GP85、GP160），其中，Gn负责病毒颗粒对受体细胞的粘附，Gc介导膜融合。类似于其它布尼亚病毒，目前认为内罗病毒属的Gc也是II型病毒囊膜蛋白，即C端在膜内的单次跨膜蛋白。

　　研究发现，CCHFV感染者血清中抗体的缺失与病人的感染致死率密切相关，提示抗体在保护感染者免于死亡中发挥作用。但目前仅有鼠源抗体发表，分别靶向CCHFV的Gc、Gn和GP38。而根据近期在其它烈性病毒，如埃博拉病毒中的研究，康复患者血中可以分离到具备治疗效果的中和抗体，甚至在感染后出现症状时再使用依然有效。

　　延续这种策略，2021年6月1日，美国爱因斯坦医学院的Kartik Chandran教授课题组联合Adimab、Mapp公司及美国陆军传染病研究所的合作者在Cell杂志发表了题为Protective neutralizing antibodies from human survivors of Crimean-Congo hemorrhagic fever的研究文章，首次报道在四名CCHFV感染幸存者体内发现361株靶向Gc和GP38的人源单克隆抗体。实验证实其中的高效中和抗体靶向Gc上的6个保守抗原表位，靶向表位不同的抗体可以通过协同作用发挥预防效果。进一步将其中的高效抗体改造为双特异性抗体，获得了一株可以有效保护小鼠免受致死剂量CCHFV攻毒的抗体。

　　作者首先构建了重组蛋白rGn/Gc作为诱饵，在四位CCHFV康复患者的血样中进行单个记忆B细胞的流式分选，经过测序，在酵母工程菌株中进行单抗的异源表达，最终得到361株抗体。而后，研究者使用生物膜干涉检测了全部抗体对rGn/Gc和Gc的结合能力，发现超过80%的抗体均可结合两种抗原，另有部分抗体特异性结合GP38，但全部抗体均不结合Gn。进一步地，检测这些抗体对三种分支（Clade III、I、V）来源的rGn/Gc的交叉结合能力，发现绝大部分的Gc特异性抗体均可同时结合三种分支来源的抗原，另有7株GP38特异性的单抗也存在交叉反应。

　　接下来，作者通过比较全部抗体与7个靶向Gc不同表位的Fab片段的竞争实验，确认大部分抗体均靶向六种表位中的一种。为确认抗体靶向的具体表位序列，作者对上述已进行表位分类的抗体进行表位定位实验：使用表面表达有Gc突变体的酵母文库，进行三轮荧光激活的流式分选，通过对Gc突变体的测序，最终确定了6组表位的具体序列信息，并将这些表位信息，在Gc结构模拟图上进行了定位（图1）。

　　图1 抗体的六组表位序列及其在Gc结构模型上的定位

　　为确定筛选出的单抗的中和效果，作者构建了包含全部结构蛋白及Nano-Glo荧光素酶报告基因的病毒样颗粒tecVLP，可以模拟真实病毒的入侵，用于对小分子和单抗的评估。以恒定的抗体浓度（35 nM），检测全部抗体对分支IV阿曼毒株tecVLP的中和效果，发现靶向Gc融合肽和结构域II的抗体显示最强的中和活性，而全部GP38特异性单抗均不具备中和活性。作者还进一步测试了活性较强抗体的广谱中和能力，确定三株抗体ADI-37801 （表位1，靶向融合肽）、ADI-36121 （表位3，靶向结构域 II）和ADI-36145 （表位6，靶向结构域III）用于后续实验（图2）。

　　图2 高效抗体的中和效果汇总

　　针对此前应用单株抗体进行治疗时易导致毒株产生逃逸突变的问题，作者在进行抗体的动物实验前，先测试了三株候选抗体作为协同抗体对的组合可能。通过将非竞争表位的抗体进行等摩尔比混合，测试了它们对阿曼及另外几种毒株来源的tecVLP的中和效果，发现ADI-37801可以与另两株抗体协同。于是，作者测试了三种抗体及两种抗体组合，在50mg/kg用量下单次注射对小鼠的攻毒预防及保护效果，结果显示全部抗体及组合在提前24小时注射时，均可以有效保护，但在攻毒后使用时则未能有效保护小鼠。为获得保护性效果，作者对三种抗体的可变区进行组合构建出4株双特异性抗体，经异源表达和纯化，分别测试了这些双特异抗体对不同tecVLP的中和效果，发现攻毒24小时后一次注射DVD-121-801即可有效保护小鼠；结果还显示，双特异抗体的构建方式影响其保护效果，两组抗体V区位置交换的DVD-145-801则不具备保护效果（图3）。

　　图3 双特异抗体构建策略及动物实验结果

　　在本项研究中，作者首次在康复病人体内分离获得数百株人源CCHFV单克隆抗体，这些抗体大多靶向Gc上的6个保守表位，部分抗体具备较强的中和活性和预防效果，通过抗体改造还获得一株具备治疗效果的双特异抗体，有望用于后续临床开发。当然，本文也存在一些问题，如近400株抗体无一靶向Gn的原因尚无定论，高效中和抗体的确切作用机制还有待结构生物学研究，本研究发现的抗体在非人灵长类及人体中的效果仍需确认。但这种从康复患者血浆中直接分离单个B细胞并通过体外实验快速鉴定候选中和抗体的策略，可推广至其他尚无有效治疗手段的病毒防控中。