香肠中亚硝酸盐的测定（盐酸萘乙二胺法）

　　一、目的

　　1、熟练掌握样品制备、提取的基本要求。

　　2、进一步学习并熟练掌握分光光度计的使用方法和技能。

　　3、盐酸萘乙二胺法测亚硝酸的原理和操作要点。

　　二、原理

　　样品经沉淀蛋白质除去脂肪后，在弱酸条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化，生成重氮化合物，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色颜料，在538nm波长下测定其吸光度与标准比较定量。本法最低检出限为0.0001g/kg。

　　三、试剂

　　1.亚铁氰化钾溶液：称取106g亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6·3H2O]，溶于水后稀释至1000ml。

　　2.乙酸锌溶液：称取220g乙酸锌[Zn(CH3COO)2·2H2O]，加30ml冰乙酸溶于水，稀释至1000ml。

　　3.饱和硼砂溶液：称取5g硼酸钠[Na2B4O7·10H2O]，溶于100ml热水中，冷却后备用。

　　4.4g/L对氨基苯磺酸溶液：称取0.4g对氨基苯磺酸，溶于100ml 20%的盐酸中，避光保存。

　　5.2g/L盐酸萘乙二胺溶液：称取0.2g盐酸萘乙二胺，溶于100ml水中，避光保存。

　　6.亚硝酸钠标准溶液：精密称取0.1000g在硅胶干燥器中干燥24h的亚硝酸钠，用蒸馏水溶解移入500ml容量瓶中，并稀释至刻度。此溶液亚硝酸钠含量为200μg/ml。

　　7.亚硝酸钠标准使用液：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液5.00ml置于200ml容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液亚硝酸钠含量为5μg/ml。

　　四、操作方法

　　1.样品处理

　　称取5.0g经绞碎混匀的样品，将其置于50ml烧杯中，加入12.5ml硼砂饱和溶液，搅拌均匀，用70℃左右的水约300ml，将样品全部转移入500ml容量瓶中，置沸水浴中加热15min后，取出冷却至室温，然后边转动边加入5ml亚铁氰化钾溶液，摇匀后再加入5ml乙酸锌溶液以沉淀蛋白质，加水至刻度，混匀，放置0.5h，除去上层脂肪后将清液用滤纸过滤，弃去初滤液约30ml，收集滤液备用。

　　2.测定

　　吸取40ml上述滤液于50ml比色管中，另吸取0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00、2.50ml亚硝酸钠标准使用液(相当于0、1、2、3、4、5、7.5、10、12.5μg亚硝酸钠)，分别置于50ml比色管中。在样品管和标准系列中分别加入2ml4g/L对氨基苯磺酸溶液，混匀后静置3-5min，再分别加入1ml2g/L盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀后静置15min，然后以2cm比色杯，用零管调节零点，于538nm波长下测定吸光度，并绘制标准曲线比较定量。

　　五、结果计算

　　X＝　　　　　　　　　　　(3-4)

　　式中：X――样品中亚硝酸盐的含量，g/kg；

　　　m――样品质量，g；

　　　A――测定用样液中亚硝酸钠的含量，μg；

　　　V1――样品处理液总体积，ml；

　　　V2――比色时吸取样品处理液体积，ml。

　　注意事项

　　1.显色时的PH值以1.9-3.0为宜，显色后稳定性与室温有关，一般认为显色温度为15-30℃，在20-30min内比色为好。

　　2.当样品中亚硝酸盐含量高时，过量的亚硝酸盐可以将生成偶氮化合物氧化，使红色消失，对结果产生影响，可以采取先放入试剂，然后再滴加试液的方法，防止氧化。