马涵慧博士再发CRISPR研究成果

　　最近在《Journal of Cell Biology》发表的一项研究中，美国麻省大学医学院的科学家，揭示了“CRISPR-Cas9机器在活细胞内如何运作”的重要新细节，对于开发使用强大基因编辑工具的治疗方法，具有重要的意义。

　　本文通讯作者、生物化学与分子药理学教授Thoru Pederson博士说：“关于‘CRISPR-Cas9复合物如何在活细胞的基因组周围四处活动并发现其靶标’的细节，我们了解甚少。在这项研究中，我们了解到这台机器是如何工作的，这对于试图开发基因编辑工具用于实验室和临床的研究者来说，是非常重要的和有用的。”

　　作为该细菌免疫系统（防止病毒入侵）的一个组件，CRISPR-Cas9复合物是一种强大 的基因编辑系统。CRISPR-Cas9适于在实验室里，它比以前的技术更有效和精确，因为科学家们能找到方法，快速地编程和传递它，以选择性地编辑用于 研究的特定基因序列。为了切割一段双链DNA，CRISPR-Cas9利用一段大约20个碱基对的向导RNA，来靶定基因组的特定靶区域，然后，Cas9 复合物将进行切割。这使得科学家能够切除基因组中的基因序列，或向基因组中插入基因序列。

　　CRISPR/Cas9系统在活细胞内如何运作的根本动力学，我们还不清楚，一些传递系统和技术已经比其他的更为成功。为了观察CRISPR -Cas9系统在一个活细胞内是如何运作的，Pederson博士和同事们开发了一种技术，能用不同的荧光分子来标记导向RNA和Cas9元件，这样就可以 同时跟踪它们。

　　他们发现，向导RNA——当不结合Cas9时，是极其短暂的。当Cas9和向导RNA进行组装时，该复合物要稳定得多，大约有一半其一生（大概十五分钟）是在细胞核内，其余的则更为稳定。

　　本文共同第一作者、Pederson实验室的研究专家马涵慧（Hanhui Ma）博士指出：“Cas9可使导向RNA稳定。如果你分别将向导RNA和Cas9传递入细胞，以让它们进行组装，它将不会那么的有效，因为一些向导 RNA会降解。如果你把它们都传递到细胞内，已经组装，你会看到更多的活性。”马博士早年毕业于中国科学院上海生命科学研究院。

　　其他的研究成员——包括RNA疗法研究所助理教授David Grunwald博士，Grunwald实验室博士后Li-Chun Tu博士发现，通过Cas9引导性RNA复合物的靶标停留持续时间，决定着DNA是否将被切割。当向导RNA序列与靶DNA序列完全匹配时，这种Cas9 引导性RNA复合物在离开之前仍然结合长达两小时的时间，同时切割完成。如果是不匹配的引导性RNA靶向DNA序列，该复合物只会持续几分钟的时间，并且 切割受损。

　　马博士说，知道了这一点，科学家就有可能通过数学方法，根据CRISPR位于基因组上多久，来预测脱靶切割可能发生在哪里。马博士补充说：“我们仍然不知道CRISPR的规则。每个人都想知道，当它进入一个活细胞时会发生什么。这项研究有助于写一篇《操作手册》。”

　　在今年4月，这个研究小组开发出了一项利用CRISPR/Cas9的新技术：CRISPRainbow，它使得研究人员能够在活细胞中标记和追踪7 个不同的基因组位点。这一标记系统将成为实时研究基因组结构的一个宝贵的工具，研究人员在《自然生物技术》（Nature Biotechnology）发布了关于它的详细资料。

　　而在2015年《PNAS》发表的一项研究中，马涵慧博士带领研究人员，利用来自三种细菌直系同源物的催化失活Cas核酸内切酶（dCas9），设 计了一种基于CRISPR的多色荧光标记系统，可特定而有区别地同时标记不同对的染色体位点。每对dCas9-荧光蛋白和同源单导向 RNAs（sgRNAs），可有效地标记人活细胞内的几个靶位点。从而可让我们评估活细胞中位点之间的距离。