高分辨熔解曲线突变检测

高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）技术是近年来兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品的分析。该方法与其他遗传分型技术相比具有灵敏度高、特异性好、成本低廉、高通量检测的优点，是进行突变检测的迅速、廉价而有效的方法。

HRM原理

HRM是在PCR基础上通过测定DNA双链熔解曲线变化来检测突变的方法，溶解曲线的变化取决于DNA序列、长度、GC含量，因此，可以通过饱和燃料监控熔解曲线的变化来反映核酸性质的差异，从而对样品进行分析。

在双链体的溶解曲线检测时需要添加合适的染料，饱和染料例如SYBR Green在双链解链过程中会发生重排，无法真实反映DNA熔解情况。不适用于需低温解链的样品而且不能检测异源双链体。因此不能用于熔解曲线的检测。而LC Green是一种与DNA有更强的结合位点，对PCR抑制作用很小的饱和染料，已成功的用于HRM检测中。

HRM操作简便，在PCR结束后添加合适的染料，通过监测升温过程中荧光染料与PCR扩增产物的结合情况来实现的，在升温过程中，双链解开，荧光染料从解链的分子上释放，同时荧光强度降低，所以通过荧光强度和曲线的变化上就可以判断是否存在突变。

图一：同源双链体和异源双链体的熔解曲线

图二：HRM数据处理过程

HRM的特点和应用

HRM应用：

• 检测人类疾病相关基因中常染色体的显隐性和X-连锁

• 鉴定人类肿瘤的体细胞突变，肿瘤样品中筛选体细胞突变

• 基因突变扫描：单碱基的改变、插入或缺失

• 特定突变、多态性位点的筛选

• 外显子和短扩增子基因型扫描

HRM特点：

• 灵敏度高：杂合子突变体的检测的灵敏度可以达到100%，原则上数据分析时温度升高后纯合子或半合子的突变时检测不到的，但实际上，许多纯合子突变是可以检测到的。如基因突变正好与x连锁，可以在PCR之前加入已知野生型样本来检测半合子或纯合子的突变。

• 特异性好：HRM的特异性可以达到90-100%。短的扩增子特异性要更高

• 不受碱基位点局限，适用范围广

• 在封闭的试管内进行，可降低污染操作简单、

• 成本低廉、时间少、误差小、高通量检测

• 检测的样品范围广：HRM检测片段范围在38-1000bp不同来源的样品都可以用于HRM如血粉、口腔细胞、冷冻的肿瘤样品、也可用于酒精固定、福尔马林固定或石蜡包埋的组织等，在人类遗传性疾病的研究中，通常用周边血液淋巴细胞中提取DNA，用于HRM分析。
  

HRM：实验设计中需要考虑的问题

• 高效的扩增方案的设计对于HRM的成功至关重要。最大的灵敏度和特异性有助于最佳的PCR结果的产生，同时扩增子的溶解特性对于结果也非常重要。这取决于引物的设计和引物的位置。

• 在实验结果中有时会出现假阳性，这时可以通过调整引物或者扩增参数避免出现假阴性的结果。

• 样品的质量对特异性有一定的影响，因此，进行HRM分析时要选用高质量的样品。

总结

HRM灵敏度高、特异性好

该方法是在封闭的试管内进行，可降低污染，因此，该技术具有操作简单、成本低廉、时间少、误差小、高通量检测的优点。是进行突变扫描的首选方法。