高效反相液相色谱

反相色谱（reversed phasc chromatography, RPC）是基于溶质、极性流动相和非极性固定相表面间的疏水效应建立的一种色谱模式，任何一种有机分子的结构中都有非极性的疏水部分，这部分越大，一般保留值越高，在高效液相色谱中这是应用面最广的一种分离模式，在生物大分子的反相液相色谱条件下，流动相多采用酸性的、低离子强度的水溶液，并加一定比例的能与水互溶的异丙醇、乙腈或甲醇等有机改性剂，大量使用的填料为孔径在30纳米以上的硅胶烷基键合相，除此之外，也有少量高聚物微球。实验表明，烷基链长对蛋白质的反相保留没有显著的影响，但在蛋白质的活性回收上短链烃基（如C₄，C₈，苯基）和长链烷基（如C₁₈，C₂₂）反相填料是有区别的。表现在烷基链越长，固定相的疏水性越强，因而为使蛋白质较快洗脱下来，需要增加流动相的有机成分。过强的疏水性和过多的有机溶剂会导致蛋白质的不可逆吸附和生物活性的损失。总起来说，在烷基键合硅胶上的反相色谱，由于其柱效高、分离度好、保留机制清楚，是蛋白质的分离、分析、纯化和结构阐明广泛使用的一种方法。

由于在反相色谱中，使用了乙腈、甲醇等价格高且有一定毒性的试剂，在一定程度上使该方法的使用受到限制。例如可使部分蛋白失活。因此，该方法用在分析鉴定方面更多一些，特别是对有机溶剂具有耐受性的样品。例如多肽样品，可用HPRPC对合成的肽huBPP进行分析。

（一）实验目的
用HPRPC对huBPP进行纯度鉴定。

（二）材料和试剂

1，仪器：高效液相色谱仪，Beckman公司gold system.

2，色谱柱：⑴ 名称：Diamonsil TM（钻石） C18柱，5цm

                      ⑵ 规格：250×4.6mm

3，试剂：甲醇（HPLC级）、三氟己酸（TFA）、乙腈  （HPLC级）、双蒸水

（三）样品准备
取待分析的huBPP，称量，用0.1%的TFA液溶解，配制成浓度大于1mg/ml的液体。必要时过滤或离心。

（四）操作

1、液体准备：A液0.1%TFA，B液液，99.9%乙腈，0.1%TFA，脱气。

2、开机

3、上柱

4、输入参数

检测波长  245nm

流速  1ml/min

流动相： A液：0.1%TFA

                B液：99.9%乙腈-0.1%TFA

洗脱条件：0-100% B  20min

5、平衡色谱柱  一般反相柱都保存在甲醇中，应置换出甲醇，用A液平衡色谱柱，待基线平稳后准备上样。必要时，可按洗脱条件不上样运行一遍程序，以洗出色谱柱可能存在的杂质。

6、上样，取20цl样，注入上样阀，将阀门扳下，即上样。

7、进行分离，鉴定。

8、打印结果，并分析，可得到峰数，峰高，面积百分比，保留时间等参数。

9、用B液洗柱5min，若不再使用时，换成甲醇，洗涤后保存。

附：色谱柱操作说明，（以迪马公司Diamonsil(TM)柱为例）

1. 色谱柱常规参数

订货号：Catalog.No.             产品ZL号 Serial No.

出厂日期  Date

填料  Column Paking     如，Diamonsil(TM)钻石C18 5цm

柱规格 Column Dimension     250×4.6mm

填料批号 Material Lot No.   0206

保证柱效 Guarantee Plate Number   N>70,000/m(usp 1/2 Peak height)

不对称因子 Asmmetry Factor        As=0.8-1.4(5% Peak height)

测试报告 （附色谱图） 略

2. 验收色谱柱

⑴ 检查色谱柱外观是否完好。

⑵按柱参数逐项检查是否与您的需求相符，如规格等。

3. 流动相使用

⑴检查色谱柱允许使用流动相及pH，如，凝胶柱常规用缓冲液，反相柱用有机溶剂，钻石C₁₈柱允许pH为2-7.5。

⑵ 注意流动相的粘度对柱后的影响，如甲醇/水系统高于乙腈/水系统。

⑶ 流动相、样品使用时过滤，常用0.45μm膜，分清水溶性和脂溶性膜。一般在色谱柱口有0.2μm的膜保护，以免堵塞色谱柱。

⑷ 流动相应脱气。

4. 色谱柱安装

⑴ 确证柱与仪器的接头，管路匹配。

⑵ 安装柱之前，检查流路系统中的溶剂是否正常。

⑶ 为减少死体积使进样阀与色谱柱和检测器之间的连接管路内径尽量细，如0.01英寸。

5. 对样品要求

⑴ 样品应与流动相互溶。

⑵ 样品浓度要在一定范围内，不同色谱柱要求不同。

⑶ 样品中不能有不溶物，用前应用针头或过滤器过滤。

⑷ 样品不应与流动相发生反应。

6. 色谱柱的使用

⑴ 色谱柱最后封装的溶剂一般与检测报告相同或特别注明，若更换流动相时，流速要慢，一般不超过0.5ml/mim。

⑵ 请勿频繁改变流动相，否则，会加速降低柱效。

⑶ 注意不同色谱柱耐压程度不同，压力要在柱耐压范围内，为获得最佳分离效果，钻石C₁₈柱使用勿超过200bar(300psi)。

⑷ 若使用保温柱时，注意温度影响。

7. 色谱柱的保存

⑴ 若流动相中使用盐或酸试剂，保存前应先用水冲洗干净（约20倍柱体积）。

⑵ 泵入保存液，不同色谱柱用不同保存液，钻石C₁₈柱应尽可能用100%乙腈或甲醇保存。

⑶ 卸下色谱柱后，立即用接头密封，放在稳定环境中保存。

8. 柱的再生

不同柱用不同方法再生，请参看各种色谱柱说明。

钻石反相键合相C₁₈、C₈、pH、CN柱用以下程序：

用20倍柱体积的溶剂按下列程序冲洗色谱柱。（按箭头方向冲）

水→甲醇→氯仿→甲醇

水冲洗时可用热蒸溜水（55℃）或加入少量（0.8%）DMSO冲洗。

一般情况下不提倡反向冲洗色谱柱，必要时可反向冲。