高效液相色谱原理

采用高效液相色谱（HPLC）法分离单糖和寡糖，较多采用氨基柱，乙腈和水作为流动相，此法具有完全分离麦汁、发酵液和啤酒中的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和麦芽三糖的优点。本文采用Hypersil NH2柱分析麦汁、发酵液和啤酒中三糖以内的可发酵糖。

至今尚未见到采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法分离测定啤酒中的各种有机酸的报道，本文采用直接RP-HPLC法，应用Nucleosil C18柱，测定啤酒、发醇液和麦汁中的草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸等有机酸。

一、实验部分

1.1药品和试剂

葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽三糖、木糖、草酸、酒石酸、丙酮酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、延胡索酸、磷酸氢二钾药品均为分析纯，乙腈为色谱纯。

1.2仪器与色谱条件

PE200系列高效液相色谱仪（PE公司）；PE200系列泵，ISS200自动进样器，PE101柱炉。

（1）可发酵糖色谱柱：预柱PE PEEK-C18 4.6 mm×10，分析柱Hypersil 5 μm NH2 4.6 mm×250；柱温：30℃；示差折光检测器；流动相：重蒸水，流速1 ml/min，进样量均为10 μl。

（2）有机酸色谱柱：预柱PE PEEK-C18 4.6 mm×10，分析柱Nucleosil 5 μm C18 4.6 mm×250；柱温：18℃；二极管阵列检测器检测波长215 nm；流动相：0.1 mol/L磷酸氢二钾，流速0.8 ml/min，进样量均为50 μl。

1.3样品前处理

测试样品需在室温20±0.5℃平衡后取样，啤酒和发酵液样品纸滤后再膜滤，取入样品瓶后直接进样；麦汁杀菌后离心取上清液依浓度而稀释，先纸滤后再膜滤，取入样品瓶直接进样。

1.4定性定量方法

（1）可发酵糖以保留时间（Rt）和标样添加定性，外标法和内标法定量。

（2）有机酸以保留时间、标样添加和各有机酸紫外吸收光谱来定性，外标法定量。

二、结果与讨论

2.1可发酵糖测定方法

（1）方法的线性关系和最小检测限 配制一定浓度的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽三糖，进样体积1 μl～100 μl，进样量C微克（μg）与峰面积（A）之间建立回归方程：以上各种糖的线性范围、回归方程及相关系数r分别为：果糖5～100 μg，C=0.6631+7.642×10－6A，r=0.9999；葡萄糖50～100 μg，C=2.8024＋6.601×10－5A，r=0.9992；蔗糖5～50 μg，C＝0．1274＋8．173×10－6A，r=0.9995；麦芽糖32～320 μg，C＝4．4336＋8.402×10－6A，r=0.9997；麦芽三糖6～120 μg，C=2.3689+8.763×10－6A，r=0.9993，最低检出限量分别为0.2685 μg、0.1844 μg、0.2261 μg、0.3585 μg、0.427 μg。

（2）方法的精密度（内标计算） 以木糖为内标，配制一定浓度的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽三糖混合标样，采用单点平均校正因子，同一样品重复进样6次，计算平标准偏差和相对标准偏差，结果为：标准偏差＜0.03；相对标准偏差＜0.4%。

（3）方法的回收率对已知含量的样品添加一定量的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽三糖，计算回收率，结果为：97.2%～99．9%。

（4）分析样品时内标法与外标法测定结果的比较同一样品内标法和外标法测定结果的比较，说明测定三糖以内的糖类，二种定量方法均可采用。

（5）结论采用Hypersil NH2柱，以重蒸水和乙腈作流动相，以保留时间和标样添加法定性，外标法和内标法定量，测定麦汁、发酵液和啤酒中的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖及麦芽三糖，此法已用于实际样品的测定。

2.2有机酸的测定方法

（1）定性方法啤酒中各有机酸保留时间的相对标准偏差＜1.4%；加入纯标样于啤酒中；对照峰高，如试样某一组分的峰高增加，表示试样中可能含有所加入的组分；啤酒中各有机酸紫外吸收光谱：草酸、酒石酸、丙酮酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸和延胡索酸在210～215 nm处均有吸收，草酸、丙酮酸和延胡索酸在254 nm处亦有吸收，其它有机酸254 nm处无吸收。

（2）定量方法的精密度和回收率取有机酸混合标样，采用单点平均校正因子，混合有机酸标样重复进样5次，采用平均校正因子，定量测定啤酒和加标啤酒样品，取5次测定值（g/100 L），计算相对标准偏差及回收率

结果为：各有机酸的相对标准偏差＜2.3%，回收率89.4%～107.8%。可见采用Nucleosil C18柱，二极管阵列检测器，以磷酸二氢钾为流动相，等速洗脱，以保留时间和标样添加及各有机酸的紫外吸收光谱定性，采用平均校正因子外标法定量，此方法适于分析啤酒、发酵液和麦汁中的草酸、酒石酸、丙酮酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸等有机酸。