高通量RNA干扰技术筛选DNA损伤实验

目前，将RNAi库和基于细胞水平的高通量分析技术相结合对于我们鉴定药物敏感性和抵抗性的新机制有非常广阔的前景。举例来说，已有研究者对全基因组进行RNAi筛选找出了导致非小细胞肺癌对紫杉醇敏感的基因。这项研究也证实了RNAi技术在发现影响癌症细胞细胞有丝分裂的靶点上具有很大潜力。

Molecular Devices公司开发了一款非常强力的筛选平台—ImageXpress系统。该系统拥有完整的图像获取及分析模块，可以快速生成想要的数据。

本文我们列举了如何通过对磷酸化的组蛋白H2AX和DNA进行免疫荧光双色分析方法来检测DNA损伤。组蛋白H2AX在丝氨酸139位点的磷酸化被认为是药物或辐射造成的DNA损伤的敏感标记。文中也阐明了我们利用RNAi对双色标定DNA损伤分析是一个敏感和快速的自动化过程，而且这种方法被证明可以有效发现新的目标。图1列举了这种分析的设置方法。

图1 通过标记磷酸化组蛋白H2AX检测DNA损伤的示意图

实验步骤

细胞及其培养条件。用加入10%FCS的DMEM培养HeLa细胞。细胞移入384孔避光且底面光洁的聚苯乙烯板(Greiner)中，密度为每孔约600个细胞。

利用ImageXpress系统检测DNA损伤。在经过RNAi及/或DNA损伤处理后，细胞固定，打孔并用相应抗体直接免疫染色组蛋白H2AX的丝氨酸139的磷酸化位点。所用二抗为抗兔Alexa Fluor-488(AF-488，Invitrogen)，propidium iodide(PI)标记所有的细胞核。ImageXpress激光扫描平台设置为绿色滤光通道(Ch1,510-540nmBP)及红色滤光通道(Ch3,600nm LP)。利用红色通道的逐区扫描可以对全板孔图像进行分析，背景则由整合了绿色及红色通道的荧光强度进行调整和修正。在图2中我们列举了阳性和阴性样本的图像。

图2 利用ImageXpress系统对DNA损伤实验的阴性和阳性孔进行整空成像，细胞生长于384孔板，左侧为绿色通道，右侧为红色通道。

结果及讨论

我们整合了ImageXpress 系统和机械加样臂对超过20000个RNAi进行筛选（数据库由斯坦福大学Karlene Cimprich 实验室提供）。我们的平台可以通过双色图像处理技术同时自动化处理图像以及定量分析细胞的DNA损伤状况。

图3 阴性(上)和阳性(下)细胞分析结果的散点图如图所示。红色的斜线为Ch3/Ch1，表示DNA损伤的阈值。阴性损伤比率为1.9%，阳性的比率为88.5%。

图4 展示了按照384孔板布局排布的RNAi筛选DNA损伤的百分比结果。阴性对照空(8个)标记为灰色，阳性对照孔(8个)标记为绿色。Z’值为0.9，其他RNAi处理孔的损伤率为13.5%，标记为橙色。

图2中列举的用磷酸化H2AX和PI染色细胞作为阴性和阳性对照，我们在图3中展示了其双参数点阵图结果。紫色分割线代表Ch3/Ch1的比率，其X轴截距可调节，而这一比率定义了自动化DNA损伤定量检测的标准。其中阴性对照样本的比率为1.9%而阳性对照样本(已经用RNAi技术处理过增加了DNA损伤几率)的比率为88.5%。

图4中我们列举了具有代表性的384孔细胞的DNA损伤百分率。阴性对照孔(n=8)用灰色表示，阳性对照孔(n=8)用绿色表示。Z’-prime值为0.9。其余用RNAi处理的和比率大于等于13.5%的孔则用橙色表示。

结论

H2AX的磷酸化已经被证实是检测离子照射和药物所致DNA双螺旋损伤的早期敏感标志。本文我们展示的ImageXpress激光扫描平台可以通过双色检测对DNA损伤进行定量。我们也阐述了这种双色DNA损伤检测具有高速，自动化，灵敏的特点。通过设计好的RNAi，我们可以筛选诱导肿瘤细胞致DNA损伤的目的基因。此平台独特的光学和扫描工具可以实现简单的“插入电源然后工作”的操作，这也同时满足了学术和工业领域生命科学研究者们的需求。