高速冷冻离心机在分离细胞核基质中的应用

核基质是指真核细胞间核中除核被膜、染色体和核仁以外的一个精密网架系统，既包含蛋白质，又包含RNA。核基质是从纯化的细胞核中分离的。要用去污剂、核酸酸处理细胞核。以分离核基质的每一步中抑制核酸酶的活性非常重要。

本文介绍1986年Comerford使用过的分离细胞核基质的方法和步骤。

1.   大鼠肝脏（50~100g）剪碎，加3倍体积的10mmol/L Tris-HCl、2mmol/L MgCl₂、250mmol/L蔗糖、1mmol/L EDTA、1mmol/L PMSF（PH=7.4，4℃）。匀浆后通过几层纱布过滤，在4℃，匀浆液以800g_max（用的是MSE Chilspin离心机，4*100ml转子，2100r/min）离心10分钟。把沉淀重新悬浮在匀浆缓冲液里，该缓冲液包含56%（质量浓度）蔗糖，再在4℃以60000g_max（用Sorvall OTD50超速离心机，A641转子，28000r/min）离心90分钟。把沉淀用20mL匀浆缓冲液洗两次。

2.   把细胞核沉淀重新悬浮在20mL STEM缓冲液中[STEM：50mmol/L Tris-HCl，50mmol/L MgCl₂、250mmol/L蔗糖、1mmol/L EGTA、1mmol/L PMSF（PH=7.4，4℃）]，加入四硫酸钠，终浓度为0.2mmol/L。在4℃孵育后，加入N-乙酰马来酰亚胺（N-ethylmaleimide，NEM），终浓度为5mmol/L。

3.   在800 g_max离心沉淀细胞核，并用20mL STEM洗三次，把细胞核重新悬浮在20ml STEM中，补加20μg/mL DNase I（Boehringer, grade I），在37℃孵育20分钟，再在800 g_max离心回收沉淀。

4.   把沉淀悬浮在20mL LS缓冲液里[LS缓冲液：10mmol/L Tris-HCl，0.2mmol/L MgCl₂、1mmol/L EGTA、10mmol/L PMSF（PH=7.4，4℃）] ,在4℃孵育10分钟, 再在800 g_max离心10分钟回收沉淀。

5.   把沉淀重新悬浮在1mL 含有70%（质量浓度）蔗糖的LS缓冲液里。上面铺放3层蔗糖梯度，各2ml 60%，50%和40%（质量浓度）蔗糖（用含2mol/L NaCl的LS缓冲液配制蔗糖溶液）。在800 g_max离心1小时，细胞核基质在40%和50%蔗糖分离界面。回收后用STEM缓冲液（10ml）洗一次。

该方法可用于各种类型细胞核基质的分离。

湖南湘立研制生产的几款医用离心机可以用来进行细胞分离，如DL5M/TDL5M两种型号的低速冷冻离心机可用来进行干细胞实验。XL03RH型控温离心机（低速冷冻离心机）可用来进行温度敏感型人体细胞分离。