高速冷冻离心机在核膜的亚分级分离中的应用

核被膜（nuclear envelope）是包被核内含物的双层膜结构，作为界膜，它把细胞核与细胞质分开，有利于稳定基因的结构，外核膜与胞质中的粗面内质网相邻，外表亦有核糖体附着，内核膜附着有一层纤维状蛋白网，该结构对内膜具有支撑作用。核间隙与粗面内质网腔相通，内含多种蛋白质和酶，核膜还控制着细胞核与细胞质之间的物质交换。

分离核膜几乎都以肝脏为原料，但不同类型的研究用不同的制备方法，有些方法适合于膜组成的研究，有些方法适合于酶与通透性研究。基本上分为低离子强度和高离子强度法。高离子浓度法用高浓度的阳离子使膜破裂，该方法能获得较高产量的膜。低离子浓度法可使膜具有形态完整并保留的酶活性高。Kaufmann等用高离子强度介质快速从鼠肝细胞核中分离完整核膜，几乎不受污染，对研究核基质和核被膜间的关系非常有用。Fraser等用DNase处理染色体分离核被膜碎片，染色体污染少。

本文讲述用高速冷冻离心机进行核膜的亚分级分离的方法和步骤。

1.         把核被膜（大约1~2mg蛋白质）悬浮在5ml冰冷的10mmol/L三乙醇胺-HCl、0.1mmol/L蔗糖（pH=7.5）中，再加入0.5ml 20%（体积分数） Triton X-100，在0℃孵育10分钟。

2.         该悬浮液，在45000g_max离心，使核被膜沉降。

3.         把沉淀重新悬浮在5mL相同的缓冲液里（不加去垢剂），再加入5ml 100mmol/L 三乙醇胺-HCl、2.0mol/L NaCl。

4.         在0℃孵育10分钟后，悬浮液再发步骤2离心，沉淀是管孔复合体叠层膜。

在所有步骤中，匀浆重悬是基本步骤，在往沉淀里加2~3滴甘油摇动或手工匀浆。用1%（质量浓度）柠檬酸（1ml/mg核蛋白）抽提细胞核来制备外核膜，通过低速离心上清液在120000g_max离心（6*14ml甩开转子，26500r/min）、4℃离心1小时来沉淀膜。

湖南湘立研制生产的几款医用离心机可以用来进行细胞分离，如DL5M/TDL5M两种型号的低速冷冻离心机可用来进行干细胞实验。XL03RH型控温离心机（低速冷冻离心机）可用来进行温度敏感型人体细胞分离。