鸡胚成纤维细胞制备实验

用鸡胚制备培养鸡胚成纤维细胞。

9 日龄鸡胚

70% 乙醇 胰酶／EDTA 无添加 MEM 培养基 完全 MEM-10 培养基

无菌解剖剪 无菌镊子 100 cm2 无菌培养皿 10 ml 注射器 无菌胰酶消化瓶（带磁力搅拌棒） CO2 培养箱 500 ml 烧杯 纱布 Sorvall 离心机 250 ml 离心管 150 cm2 组织培养瓶

1. 将 10 只 9 日龄鸡胚有空气部分朝上放置，喷上 70% 乙醇。

2. 用无菌的解剖剪将鸡蛋的顶部打开，剪掉膜上蛋壳，使膜保持完整。用无菌镊子将膜取掉。其他鸡蛋亦重复相同操作。

3. 取出鸡胚，放入无菌的 100 cm² 培养皿。

4. 剪掉每个鸡胚的头和足，将剩余的身体放入无菌的 100 cm² 平皿中，加入 10 ml 无添加剂的 MEM 培养基。通过 10 ml 注射器（5 个鸡胚/注射器）挤压，将鸡胚切碎并打人无菌的胰酶消化瓶中。

5. 加入 100 ml 37℃ 的胰酶/EDTA，并在加湿的 5% CO₂ 培养箱中 37℃ 持续搅拌温育 5 min。

6. 将液体从无菌胰酶消化瓶中倒人杯口带两层纱布的 500 ml 烧杯，将过滤后的液体转移至 250 ml 离心瓶中。

7. 向含有剩余组织的无菌胰酶消化瓶中加入 100 ml 新鲜的胰酶/EDTA，37℃ 温育。

8. 将消化液倒入另一个杯口带两层纱布的 500 ml 烧杯，并将过滤后的液体加入先前的 250 ml 离心瓶中。

9. 在 Sorvall RC-3B 离心机中，4℃，1200 g 离心 10 min。

10. 丢弃上清，加入 10 ml MEM-10 完全培养基，反复抽吸 10～15 次重悬沉淀，并将体积调整至 100 ml。

11. 将悬液转移至 250 ml 离心瓶中，4℃，1200 g 离心 10 min。

12. 用 5 ml MEM-10 完全培养基重悬沉淀，并将体积调整至 30 ml。

13. 将细胞悬液按每瓶 1 ml 加入到 30 个含有 30 ml MEM-10 完全培养基的 150 cm² 组织培养瓶中。

14. 37℃ 培养几天直至细胞长满，然后将培养瓶转移至加湿的 5% CO₂ 培养箱中 31℃ 保存。

CEF 细胞培养液能够在 31℃ 保存 2～3 个星期。原代的 CEF 细胞也能直接用于病毒生长，或将胰酶处理后的 CEF 细胞冻存在液氮中留以后使用。