发布时间:2019-04-20 08:09 原文链接: 黑豆蚜脱共生的分子诊断

实验概要

蚜虫胞内共生菌研究的关键环节是共生菌的脱除及体外培养,脱共生效果的准确判断是保证试验结果正确的重要因素。本研究的目的是寻找一种方便有效的脱共生效果的鉴定方法,为进一步研究蚜虫与其胞内共生菌的关系提供有效的检测手段。

主要试剂

利福平(Rifampicin,Serva产品);盐酸金霉素(Chlortetracycline HCl),BIB分装;氯霉素(Chloraomycetin),Amresco分装;盐酸土霉素(Oxytetracycline HCl)BIB分装;青霉素G钾盐(Penicillin-G K Salt),BIB分装;硫酸链霉素(Streptomycinsulfate),BIB分装。以上抗生素均为化学纯研究专用抗生素。

实验材料


黑豆蚜用盆栽蚕豆(Vicia faba L.)苗饲养,温度23-25℃,光周期16:8。

实验步骤

1. 抗生素处理方法

将2周大的蚕豆苗用蒸馏水冲洗干净,凉干表面水分后,将其根部浸泡在浓度为0.2mg/ml的抗生素溶液中,24小时后接0日龄若蚜,2天后将所有蚜虫转入正常植株饲养。处理5天和10天后分别取样,抽提DNA。

2. DNA抽提

将正常蚜虫及抗生素处理过的蚜虫于裂解缓冲液中匀浆,用蛋白酶 K处理过夜后,按照常规的酚-氯仿法进行DNA抽提。

3. 引物设计及PCR反应

利用Shigenobu等(2000)报导的巴克纳氏菌基因组中rrl-aroE基因序列和Primer Premier 5.0软件设计引物,从中选取一对S:5'-gtc ggc tca tca cat cct3'和A:5'-ttc cgt ctg tat tat ct cct3’进行PCR反应,扩增片段长度为799bp。PCR反应条件为:94℃变性2min后,进行35循环,每个循环为94℃变性30秒,55℃退火30秒,72℃延伸1分钟。

4. 电镜观察

选取处理7天后的正常蚜虫以及利福平处理过的蚜虫,经戊二醛固定液固定后进行电镜切片观察。