（双光子、共聚焦）荧光显微镜和普通显微镜的区别

　　最近试着做了一些小鼠的冰冻切片，接下来要使用荧光显微镜看自己打的病毒是否在自己想要的脑区。荧光显微镜的一些基本原理需要简单学习一下，也在此分享一下。

　　荧光显微镜是利用紫外线为光源，用以照射被检验的物体，使该物体发出光源，然后在显微镜下进行对物体的观察。主要是用于免疫荧光细胞，主要是由光源、滤板系统和光学系统组成的在通过目镜和物镜的放大来观察样本的荧光图像。我们来看下这荧光显微镜和普通光学显微镜有什么样的区别。

　　1、在照明方式上看

　　荧光显微镜的照明方式一般是用落射式，也就是说光源是通过物镜来投放于试验样本上。

　　2、在分辨率上看

　　荧光显微镜利用的是紫外线做为光源，波长比较短，但是分辨率却高于普通的光学显微镜。

　　3、在滤光片上的不同

　　荧光显微镜是用了两个特殊的滤光片，在光源前用是用来滤出可见光，在物镜和目镜之间的使用来滤出紫外线，这样可以保护人的眼睛。

　　荧光显微镜也属于光学显微镜的一种，主要是荧光显微镜所激发的波长短，所以这才导致了荧光显微镜和普通显微镜杂结构构造和使用上的不同，荧光显微镜大都有良好的捕捉弱光的功能，所以在极其微弱的荧光下，它的成像能力也和好。再加上近年来对荧光显微镜的不断改善，噪音也大幅度降低。因此越来越多的荧光显微镜得到应用。

　　双光子荧光显微镜有关知识

　　双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有 100飞秒，而其频率可以达到 80 至 100 兆赫。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。

　　在一般的荧光现象中，由于激发光的光子密度低，一个荧光分子只能同时吸收一个光子，再通过辐射跃迁发射一个荧光光子，这就是单光子荧光。对于以激光为光源的荧光激发过程，则可能产生双光子甚至多光子荧光现象，这时所用的激发光源强度高，光子密度满足荧光分子同时吸收两个光子的要求。以一般的激光为激发光源的过程中，光子密度仍然不足以产生双光子吸收现象，通常采用飞秒脉冲激光器，其瞬时功率可以达到兆瓦量级。因此，双光子荧光的波长比激发光的波长短，相当于半激发波长激发产生的效果。

　　双光子荧光显微镜有很多优点：

　　1）长波长的光比短波长的光受散射影响较小容易穿透标本；

　　2）焦平面外的荧光分子不被激发使较多的激发光可以到达焦平面，使激发光可以穿透更深的标本；

　　3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小；

　　4）使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。所以，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。

　　共聚焦荧光显微镜有关知识

　　共聚焦荧光显微镜基本原理：采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。两者的几何尺寸一致，约100-200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。

　　每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，这个光学横切面总是有一定厚度的，又称为光学薄片。由于焦点处的光强远大于非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深近似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，形成待观察样品聚焦光斑处二维的光学切片。把X-Y平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维图像。

　　即检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔。

　　激光共聚焦的工作原理简单表达就是它采用激光为光源，在传统荧光显微镜成像的基础上，附加了激光扫描装置和共轭聚焦装置，通过计算机控制来进行数字化图像采集和处理的系统。