2009年最值得关注的技术：PCR

　　摘要： 澳大利亚阿德莱德大学的研究发明出一种温度转变PCR(temperature-switch PCR)，在单个反应管中发生两次扩增，实现了基于PCR的SNP基因分型1。这种技术减少了优化单个反应的需要。

　　PCR技术自诞生以来，20多年始终重复着变性、复性、延伸三步曲，虽说PCR酶的改进不少，但主旋律始终不变。直到今年，PCR有了一些技术上的进步，也值得我们关注。

　　最近，澳大利亚阿德莱德大学的研究发明出一种温度转变PCR(temperature-switch PCR)，在单个反应管中发生两次扩增，实现了基于PCR的SNP基因分型[1]。这种技术减少了优化单个反应的需要。

　　温度转变PCR使用两组精确设计的引物：在第一阶段一对位点特异的引物富集靶序列，接着在第二阶段，一对巢式引物只扩增包含待分析等位基因的DNA。两组引物对的退火温度存在很大差异，从而实现了在反应不同阶段的结合。

　　对于SNP分析而言，温度转变PCR具有很好的灵敏度和特异性。它能够扩增60-500 bp的等位基因，之后用电泳或高分辨率的熔解曲线分析来检测。这种分析对不同浓度和质量的DNA都奏效，起始浓度低于100 ng则更佳。研究人员通过盲法试验，说明了温度转变PCR具有高的基因分型准确性。

　　另一方面，在目前盛行的新一代测序中，扩增大量目的序列是必要的一环。加利福尼亚大学Kelly A. Frazer教授领导的研究小组发现以微滴(microdroplet)PCR为基础的序列富集比传统PCR更有效[2]。

　　在《Nature BioTechnology》发表的文章中，他们认为微滴PCR极其高效，能高度重复地扩增样品中的目的序列。利用RDT 1000序列富集仪器(RainDance Technologies)，研究人员产生的等位基因偏移误差率在0.1%。

　　Frazer认为：“与其它类型的序列富集相比，我们能够更均一地覆盖目的序列。此外，普通PCR常常遇到的问题，如引物设计困难和高的等位基因偏移，在微滴PCR中观察不到。”

　　研究人员认为微滴PCR显示出目的序列与背景序列的比例较高，即使是同时扩增3900多个目的序列。而这些优势将转化成更高的测序效率，让群体研究更为经济。

　　参考文献：

　　[1] Tabone T. et al. Temperature Switch PCR (TSP): Robust assay design for reliable amplification and genotyping of SNPs. BMC Genomics 10:580 (2009)

　　[2] Tewhey R. et al. Microdroplet-based PCR enrichment for large-scale targeted sequencing. Nature Biotechnology 27, 1025 - 1031 (2009)