2012最受欢迎的测序文章，点滴决定成败

　　作为测序生力军的第三代测序技术能够大大增加测序的效率和通量，不过很显然第二代测序技术仍会继续被广泛采用。近日BioTechniques杂志评出了今年最受欢迎的两篇测序文章以飨读者，而这两篇文章正是目前技术过渡时期的写照。

　　近年来，基因组学、转录组学和宏基因组学等领域迎来了爆炸式的增长，这都要归功于高通量测序技术的日新月异。尽管第二代测序方法最终会被新技术取代，但在不远的将来这一成熟技术仍将被研究人员们广泛采用。

　　下面为您介绍的是今年BioTechniques杂志上最受欢迎的两篇测序文章，一篇显著降低了二代测序技术文库制备阶段的PCR扩增偏好，一篇优化了第三代测序方案使其能更有效地帮助人们完成基因组草图。这两篇文章受到的极大关注也说明，虽然引入新方法或对实验方案进行独创性修正极易受到广泛关注，但对公认的成熟技术进行优化修补也同样重要，二者都能给科学家们带来很大帮助。

　　构建测序文库是第二代测序的经典步骤，经PCR扩增得到足够产物用于测序是非常关键的一步。不过扩增时的PCR偏好往往会导致严重的问题，PCR偏好会使扩增后的文库无法再现原始样品中的复杂性，从而影响以测序为基础的各种组学分析。Dabney和Meyer二月份发表的这篇文章描述了他们在制备 Illumina人类基因组DNA测序文库的过程中，对十种不同PCR聚合酶/缓冲体系进行了系统性和综合性评估，分析了这些体系对两种PCR偏好性的影响(GC含量和片断大小)。此外，他们还详细评估了一系列PCR 聚合酶/缓冲液体系在建立古代人类DNA测序文库中的表现。古代DNA样本是一种极端情况，因为样本质量差会严重放大PCR偏好性的影响。但令人惊讶的是，在GC含量和片断长度偏好性上表现最糟糕的就是以往最广为推荐适宜Illumina文库构建的PCR聚合酶，对现代和古代DNA样本来说都是如此。不过，文章也推荐了最佳PCR 聚合酶/缓冲液体系，这对于正在进行第二代测序的研究者们来说非常宝贵。这项研究向人们展示，即使是相当成熟的二代测序技术也还有相当大的优化空间，这一点令人振奋。

　　第二代测序技术的发展已经使基因组测序的时间和成本大大降低，近年来已测序的生物数量呈指数增长。现在的当务之急是填补基因组草图中的缺口，对一些不确定的区域进行重测序，以得到高质量的完成基因组。这样的工程需要对覆盖基因组缺口和重测序区域的PCR扩增子进行定向测序，但如果分别对这些扩增子单独进行 Sanger测序成本就太高了。显然将各种长度的PCR扩增子混合在一起形成文库，再利用第三代测序技术进行测序更为划算，例如用测序读长更长的 Pacific Biosciences(PacBio)单分子测序方法。不过这一技术本身也存在一定的偏好性，较短的PCR扩增子会优先进入PacBio反应孔，从而使较大扩增子的覆盖度可能不够。Han及其同事在七月份发表的这篇文章中，对PacBio方案进行了简单的改动，有效克服了上述障碍。他们在PCR扩增子加入到扩增子池中时，依据各扩增子的大小调节其molar mass ratio，由此大大增加了对较大扩增子的测序覆盖度。他们用这一方法来补全16种不同细菌的基因组，几乎填补了所有大于2.5kb的基因组缺口，这样的缺口是无法用一轮Sanger测序就补全的。显然，这一技术更有效也更经济，将大大推动基因组补全项目，也会使PacBio平台得到更广泛的应用。