2.2.2从富含多糖的植物组织中提取和纯化RNA

0.75mol L柠檬酸钠N-月桂肌氨酸(N-lauroyl sarcosine)硫氰酸胍缓冲液抽提缓冲液氯仿异戊醇2mol L乙酸钠酸性苯酚异内醇乙醇2mol L乙酸钾10mol L LiClTNE缓冲液TE缓冲液液氮

研钵和研杵离心机玻璃 Pasteur 吸量管

一 材料与设备

1)0.75mol/L 柠檬酸钠，pH7.0(含柠檬酸）, 用 0.1%DEPC 处理并高压灭菌

2)10%(m/V)N-月桂肌氨酸 (N-lauroyl sarcosine)

3) 硫氰酸胍缓冲液：用 293 ml 无菌去离子水，17.6 ml0.75mol/L 柠檬酸钠,26.4m 丨 10%N-十二醇肌氨酸钠，在厂家药瓶内于溶解 250 g 硫氰酸胍 (不用称重)

4) 抽提缓冲液：每 5 ml 硫氰酸胍缓冲液加 36ul 巯基乙醇。若被提取的组织中含多聚苯酚，抽提缓冲液中则可加入聚乙烯聚吡咯烷酮 (polyvinypoiypyrrolidone)(20%，m/m)

5) 氯仿：异戊醇 49:1(V/V)

6)2mol/L 乙酸钠，加乙酸至 pH4.0

7) 酸性苯酚:500 g 晶体苯酚溶于 500 mli 离子水中，50 ml 每份于-20℃ 保存，4℃ 可保存一个月

8) 异内醇

9)70% 和 100% 乙醇

10)2mol/L 乙酸钾，加冰乙酸至 pH4.8

11)10mol/L LiCl

12)TNE 缓冲液：10 mmol/LTris-HCl,PH7.5, 室温，15 mmol/L,NaCl，1 mmol/LEDTA

13)TE 缓冲液:l0 mmol/LTris-HCL PH7.5 1 mmol/LTEDTA

14) 研钵和研杵

15) 液氮

16) 离心机

17) 玻璃 Pasteur 吸量管，200℃ 干烤至少 3 h


二 操作方法

1) 在液氮中将 0.4 g 组织研磨为细粉末，勿让组织解冻

2) 在研磨过程中，加入 3.5 ml 抽提缓冲液，充分研磨。将匀浆转移到一个 10 ml 聚丙烯管=用 1 ml 抽提缓冲液冲洗研杵和研钵，然后移至聚丙烯管中。

3)23000 g，4℃, 离心 20mim

4) 用烤过的玻璃吸量管将 hS 悬浮液移入 l0 ml 聚丙烯管。

5) 加 0.4 ml2mol/L 乙酸钠，混匀。加 4 ml 苯酚，混勻。加 0.8 ml 氯仿：异戊醇，混匀。

6) 聚丙烯管置于冰上 15 min

7) 离心，方法如步骤 3)

8) 用烤过的玻璃吸量管将上层悬浮液移入 30 ml 聚丙烯管，加入同样容积的 2mol/L乙酸钾，混匀。

9) 聚丙烯管置于冰上至少 30 min

10)44000 g，4℃ 离心 20 min。

11) 将上清液移入 15 ml 聚内烯管，加 0.6〜1 倍体积的 100% 的预冷异丙醇，混匀，-20℃ 放置 45 min

12) 以 27OOOg，于 4℃ 离心 20 min

13) 轻轻倒出上清液，用 Iml70¾乙醇洗涤沉淀，如步骤 12 离心 3mim 尽可能将乙醇倒净。

14) 加人 400ulDEPC 水溶解沉淀，移至 1.5 ml 管中。

15) 加 100ul10mol/LLiCl, 放置至少 2 h。

16)12000 g，离心 20 min

17) 用 1 ml70% 乙醇洗涤沉淀两次

18) 加入 200ulTNE 重悬沉淀，再加 500ul100% 乙醇，-20°C 放置至少 15 min。

19) 如步骤 16 离心 5mim。

20) 用 lml70% 乙醇洗涤沉淀两次。

21) 加入 200〜400ulTE 重悬沉淀。

22) 将每个样本稀释 30〜50 倍，在 230mn、260mn、280nm 测量光吸收值。

1) 最初的离心除去了大部分不溶性多聚糖，如淀粉颗粒。残余的组织在管的底部形成暗绿色沉淀 (若用的是叶子），不溶性多糖在残余组织上面形成灰白色胶状层

2) 当吸取上清液时，应十分小心，勿搅乱胶状沉淀，因为该层非常软。上清液的体积大约 4 ml，若因沉淀多面使液体体积明显不足时，用柚提缓冲液补足

3) 加人乙酸钾后，延长孵育时间（达 30 min) 会提高 RNA 的质景，尤其在出现蛋白污染时。多糖会形成灰白色胶状沉淀。若所用的组织多糖含量髙. 延 K 孵育时间（至 60 min) 也有助于沉淀更多的多糖

4) 加人异丙醇后，不应看到沉淀，任何可见的沉淀是表明大量多糖的存在. 孵育时间大于 60 min，就会形成多糖沉淀

5)RNA 沉淀应为白色，若有灰白色胶状沉淀则为多糖污染。遇到该情况，将沉淀再悬浮于 200ul TE, 加 1 倍体积的 2mol/L 乙酸钾，冰上孵育 30 min。12000 g，4°C 离心 20 min. 将上清液移至一新 1.5 ml 管中，用 2.5 倍体积的 100% 乙醇沉淀RNA,-20℃15 min。继续方法中的步骤 16)

6) 判断 RNA 分离的成功与否，可通过测量在 230nm、260nm、280mn 处的紫外吸收来评估 RNA 的产量和质量。若 A_260/230 值小于 2, 则表明多糖和/或多聚苯酚污染；若A_260/280 比值小于 1.7, 表明蛋白污染，在琼脂糖凝胶匕出现的 28S 和 18S rRNA，可用以评 估 RNA 的完整性

7) 该法提取的 RNA 适于 poly(A)+ 的分离，Northern 印迹分析，cDNA 分析，RT-PCR 扩增。