2.8.1流感病毒RNA提取

10×RSB 溶液10%SDS蛋白酶 KlOXLiCI 溶液RSB 饱和的酚氯仿异戊醇2mol L 乙酸钠 无水乙醇TSE 溶液LiCl 缓冲液平衡酚TSE 饱和酚4mol LLiCL

一 材料与设备

1. 酚提法

1)10×RSB 溶液：O.Olmol/LTris，O.OOlmol/LKCl,0.0015mol/LMgCL2

2)10%SDS

3) 蛋白酶 K，5 mg/ml

4)lOXLiCI 溶液:5%SDS，0.lmol/L 乙酸钠，1.4mol/LLiCl。

5)RSB 饱和的酚.

6) 氯仿：异戊醇 (24:1)

7)2mol/L 乙酸钠。

8) 无水乙醇。

2.LiCl 提取法

1)TSE 溶液。

2)10%SDS,

3) 蛋白酶 K(10 mg/ml)。

4)lOXLiCl 溶液：5%SDS，0.lmol/L 乙酸钠，1.4mol/LLiCl

5)LiCl 缓冲液平衡酚

6) 氯仿

7)2mol/L 乙酸钠

8) 无水乙醇，

3) 酚-SDS 提取法

1)TSE 溶液

2)10%SDS

3)TSE 饱和酚

4)4mol/LLiCL

5)2mol/L 乙酸钠。

6) 无水乙醇。

二 操作方法

1. 酚提法


1) 在 4 ml 纯化病毒悬液中加 1/10 容量 1OXRSB，0.12 ml10%SDS，0,4 ml 蛋白酶 K, 置 56℃15 min

2) 在上述溶液中加 0.8 mllOXLiCl 溶液和 4 ml 用 RSB 饱和的酚，56°C 振摇 5 min, 立即冰浴。

3) 加 4 ml 氯仿：异戊醇（24:1)，室温摇 15 min,3000r/min，离心 10 min。

4) 取上层水相，再加 4 mlRSB 饱和酚和 4 ml 氯仿：异戊醇，如此重复 1〜2 次

5) 取上层水相，加 0.1 倍体积的 2mol/L 乙酸钠，2.5 倍体积的无水乙醇,-20℃ 或-70℃ 下保存。


2.LiCl 提取法


1) 纯化病毒重悬于 2 mlTSE 中，加 70ul10%SDS(终浓度为 0.3%), 再加 100ul 蛋白酶 K(10 mg/ml)，置 56℃ 下 15 min。

2) 加 0.2 ml10XLiCl 缓冲液，1 ml 用 LiCl 缓冲液平衡的酚溶液，轻揺，2000r/mm 离心 5 min

3) 取上层酚相，加 0.5 ml1XLiCl 溶液，提取 1 次，2000r/min 离心 5 min

4) 取上层水相与 3) 中所得到的下层水相混合，再加 1.2 mlLiCl 平衡的酚，轻摇，2000r/min 离心 5 min。

5) 弃上层酚相，加 1.2 ml 氯仿，轻揺，2000r/min 离心 5mim。

6) 取上层水相，加 0.05 倍体积 2mol/L 乙酸钠倍体积的无水乙醇，在-20°C 或-70℃ 保存


3. 酚-SDS 提取法


1) 将纯化病毒重悬于 2 mlTSE 中，加 0.2 ml10%SDS，轻摇至悬液澄清为止。

2) 加 2 mlTSE 饱和酚，在冰浴中轻摇 5 min,3000r/mim 离心 lOmin。

3) 取上层水相，再用 TSE 饱和酚提取 2〜3 次。

4) 取上层水相，加 100ul4mol/LLiCl，0.05 倍体积 2mol/L 乙酸钠，2.5 倍体积的无水乙醇，在-20°C 或-70℃ 下保存。