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真核细胞结构组分的差异去垢剂分离实验——基本方案

实验方法原理差异去垢剂分离法（differentialdetergentfract10nat10n,DDF)包括使用一系列含不同去垢剂的PIPES缓冲液对细胞进行连续抽提，首先是毛地黄皂苷，其次是Triton,最后是Tween/脱氧胆酸盐。这些步骤产生4种在生化和电泳上相异的组分(见图3.3和表3.7)。包括：①胞质蛋白和可抽提的细胞骨架组分。用镁沉淀的方法可以从这个组分中初步纯化出微管组分（见本方案的附加方案：用镁沉淀微管蛋白和微管结合蛋白）。②膜和细胞器蛋白。使用TritonX-114可以富集完整的③核膜蛋白和可抽提的核蛋白。④抗去垢剂的细胞骨架纤维和核基质蛋白。骨架结合蛋白及其相互作用可进一步用不同浓度的脲来抽提、分析。实验材料悬浮或单层细胞培养物试剂、试剂盒去垢剂提取缓冲液PBS丙酮裂解缓冲液仪器、耗材离心机冷冻干燥机实验步骤细胞制备①在冰上预冷细胞培养物，然后用冰浴的盐溶液、PBS或其他的非变性缓冲液洗2〜3次。保存1......阅读全文