3.5RNA反转录

poly(A)+RNA反转录酶鼠源反转酶 或禽源反转录酶

oligo(dT)12-18lmol LTris-Cl1mol LTris-Cllmol LKC125 mmol LMgCl2dNTP 混合物0.lmol LDTTRNasin

一材料与设备

1)poly(A)⁺RNA,lmg/ml

Z)oligo(dT)_12-18,lmg/ml

3)lmol/LTris-Cl（pH7.6)。

4)1mol/LTris-Cl(pH8.3)

5)lmol/LKC1

6)25 mmol/LMgCl₂

7)dNTP 混合物，各 5 mmol/L

8)0.lmol/LDTT

9)RNasin。

10) 反转录酶，鼠源反转酶 (Pharmacia 公司，200U/ul) 或禽源反转录酶（20U/ul)


二、操作方法

(一) 使用鼠源反转录酶合成 cDNA

1) 在灭菌微量离心管中混合下列物质，并置于冰上:

Poly(A)⁺4RNA,lmg/ml                                          10ul

oligo(dT)_12-18,lmg/ml                                          10ul

lmol/LTris-Cl(pH7.6)                                             2.5ul

lmol/LKC1                                                          3.5ul

250 mmol/LMgCl₂                                                2ul

dNTP 混合物，各 5 mmol/L                                 10ul

0.lmol/LDTT                                                        2ul

RNasin                                                             25U

鼠源反转录酶                                                    200U

加水至总体积为                                                 50ul

2) 于 37°C 反应 lh

3) 纯化回收. 保存于一 20℃

(二）使用禽源反转录酶合成 cDNA

1) 在火菌微量离心管中混合下列物质，井置于冰上:

poly(A)⁺RNA,lmg/ml                                             10ul

oligo(dT)12-18,lmg/ml                                           10u1

lmol/LTris-Cl(pH8.3)                                              2.5uI

lmol/LKC1                                                            3.5ul

250 mmol/LMgCI2                                                 2ul

dNTP 混合物，各 3 mmol/L                                   10ul

0.lmol/LDTT                                                          2ul

RNasin                                                                25U

禽源反转斌酶                                                       40U

加水至总体积为                                                    50ul

2) 于 42℃ 反应 lh

3) 纯化冋收，保存于一 20℃

1) 可以先进行小规模的预实验以确定反转录酶的用量。

2) 在反应中加入 [α³²P]dCTP，可以通过放射性自显影检测反转录的质量和产率

3) 对于具有不利于转录反应的二级结构的 mRNA 的转录，使用最适温度为 42℃ 的禽源反转录酶可能取得较好的结果。

4）除使用 oligo(dt)_12-18 外，在反转录反府中也可以使用长度为 6 的随机寡聚核苷酸。

5) 随若基因芯片技术的发展和逐渐普及应用，产生了由 mRNA 反转彔而获得荧光标记 cDNA 探针的方法。与常用的 RNA 探针同位素标记不同之处就在于其加入了荧光染料 Cy3 或 Cy5 代替了冋位素标记的 dNTP。