4大基因测序技术在无创性产前检测中的应用

　　近年来，通过高通量测序技术检测孕妇外周血中游离胎儿DNA（cfDNA）筛查胎儿染色体多倍体异常的无创性产前检测( noninvasive prenatal testing， NIPT)技术正越来越多地用于临床，其具有安全性、高效性及准确率高的特点，正在给产前诊断技术带来革命性的变化。NIPT技术可以3种途径介入产前检查:替代血清学筛查、替代有创产前产前诊断、作为血清学筛查与有创诊断的中间步骤。临床期待NIPT技术能够替代现行的孕妇血清学筛查与羊水胎儿脱落细胞染色体分析等有创产前诊断技术，国内外学者对此均陆续开展了相关的研究。为此，小编将对NIPT技术及基因测序技术在临床应用进行汇总。

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什么是NIPT技

　　在临床上，NIPT技术相对于羊膜腔穿刺、绒毛取样、脐血穿刺而言，不需要经“有创穿刺”即可获得胎儿遗传物质进行相关的检测分析。虽然，早在1997年已经证实孕妇外周血中存在 cfDNA，且其含量与代谢半衰期等特点均适合用于产前检查，但直到高通量测序技术的出现才使得基于 cfDNA的NIPT技术的临床应用成为可能。孕妇血浆样品中可检测到母源性和胎源性的DNA分子，如果母体健康正常，基因组是整倍体，孕妇血浆DNA分子拷贝数的非整倍体偏差，一定是由胎儿染色体异常所致。采用高通量测序技术通过对孕妇外周血中各条染色体对应 cfDNA拷贝数的检测，计算来源于21号、18号、13号等染色体的 cfDNA是否增加，以筛查胎儿是否为唐氏综合征等。

　　当前，临床NIPT技术主要包括鸟枪法大规模平行测序技术(s-MPS)、靶向的大规模平行测序技术(t-MPS)以及基于单核苷酸多态性的NIPT技术。其中，s-MPS可用于所有非整倍体的检测，对于非嵌合的21三体、18三体、13三体的检测有效性已经得到验证。t-MPS主要针对21号染色体、18号染色体、13号染色体进行选择性扩增，计算目标染色体是否相对过量。单核苷酸多态性的NIPT技术通过测序分析扩增产物，根据SNP在色体的位置以及存在重组的可能性，计算出胎儿是正常体、非整倍体或三倍体(21三体、18三体、13三体以及性色体异常)的最大似然比。该技术可以验证胎儿染色体同源的区域，因此，可以检出同源或者单亲二倍体。

基因检测技术在NIPT中的应用

　　全基因组扩增技术(WGA)

　　WGA是一种对全部基因组序列进行非选择性、均匀扩增的技术，可以在保持基因组原貌的基础上最大限度地增加基因组DNA的量。该技术可对痕量DNA(检测灵敏度可达5pg)进行扩增，为后续的基因组分析提供足量的模板。常用的WGA主要分两类:一类是以PCR为基础，如使用变性寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)、引物延伸预扩增PCR(PEPPCR)；另一类是不以PCR为基础，如多重置换扩增(MDA)。由于以PCR为基础的WGA易产生非特异性的扩增，位点覆盖率不完全，且DNA片段长度一般小于1kb，使其应用受到限制

　　比较基因组杂交(CGH)

　　CGH基本原理是分别用不同的荧光标记体系标记来自待检组织和正常组织的全基因组DNA(分别称为测试DNA和参照DNA)，各取等量标记产物制备成混合探针，与足够量的同一种属来源的Cot-IDNA先进行预杂交以封闭基因组上的重复序列，然后与正常中期分裂相进行染色体原位杂交。测试DNA探针和参照DNA探针竞争性地与染色体上的靶序列杂交，经计算机软件分析，将染色体上每一像素上测试DNA参照DNA荧光强度的差异进行计算，以研究测试DNA拷贝数的增多或缺失。该技术不需细胞培养，一次杂交实验即可在整条染色体或染色体区带水平对不同基因组间DNA序列拷贝数的差异进行检测并定位。为了解决传统的CGH杂交时间太长，研究人员将基因芯片和CGH结合，形成新技术-微阵列比较基因组杂交技术( microarray-CGH，又称 array-CGH)。其原理与CGH相似，不同之处是用微阵列(即基因芯片)代替了中期分裂相，荧光标记的测试DNA探针和参照DNA探针竞争性地与微阵列中的短片段靶序列杂交，这样就缩短了检测时间，达到灵敏快速、自动化在临床遗传学诊断中有较好的应用前景。

　　在个案研究中，研究人员利用 array-CGH发现了许多新缺失，如带有12122123.2间隙式缺失的畸形胚胎、新12p-三体综合征以及带有15q15.3-21.3间隙式缺失的短股骨分离畸形胚胎的。Gruchy等收集了38例高危孕妇(其中某些存在胎儿宮内发育迟缓和/或胎儿畸形)已细胞培养过的羊水细胞DNA和羊水 CfDNA进行arrayCGH诊断，结果显示直接提取于羊水的 cfDNA得到了很好的结果(8%的畸形确诊率，同时也经传统核型分析验证过)。已培养的羊水细胞DNA，直接提取cfDNA的优势在于可在妊娠晚期进行，而羊水细胞培养则不行。

　　第二代测序技术(NGS)

　　NGS为新一代测序技术，其主要原理是:①每个位点以单分子原DNA模板合成新DNA同时测序，在此过程中添加不同种dNTP会释放出不同的荧光；②巨大数量位点上各DNA短片段测序以阵列方式同时平行进行。通过测定每种分子序列的频率定量地反应其在原DNA库中的频率，同时测出的序列准确、定性地反应其在原DNA库中的序列，如有背景信号造成序列不符很容易在结果中滤除。

　　由于NGS的高效性及高准确率，研究人员将其作为无创产前基因检测技术，直接取材于孕妇外周血中存在的 CfDNA，应用于胎儿染色体非整倍体的临床检测。Chiu等人提取了753例孕妇的外周血cf核酸，并用二代测序技术进行测序，准确诊断出86例孕妇怀有21三体的胎儿。21体的阳性预测率为96.6%，阴性预测率为100%，灵敏度达到100%，特异性达到97.9%。 Palomaki等用染色体核型分析方法和二代测序方法分别对212例已证实怀有21三体胎儿的孕妇和1484例正常孕妇进行cf核酸检测。结果显示，21三体的检出率为98.6%，假阳性率仅为0.2%。除了检测21三体以外，这项技术还可用于鉴定18三体和13三体，检出率高达100%和91.7%7。Dan等可募集到11105例孕妇，利用二代测序进行了胎儿21三体和18三体综合征的检测，结果共检测出190例(1.17%)染色体数目异常患者，包括143例21三体综合征患者以及47例18三体综合征患者。通过对阳性结果进行核型分析以及胎儿出生后的随访，研究人员发现所检测出的21三体和18三体综合征病例中均有一例假阳性；而在对所有的阴性病例及胎儿出生后的随访中发现没有出现假阴性。因此，本次临床结果显示二代测序无创产前基因检测技术的敏感度达到100%，准确度达到99.96%。

基因测序与单基因病诊断

　　除了临床中检测21三体、18三体、13三体以外，基因测序继续在无创产前诊断单基因病（NIPD）中也发挥重要作用。在常色体显性遗传病单基因疾病诊断中，软骨发育不全( achondroplasia)是第一个进入临床实践的单基因遗传病之一，是以肢体短小为特征的常染色体显性遺传性疾病，98%的致病基因位于4号染色体短臂FGFR3基因上的c，1138G>A突变，部分为新发突变，与父亲高龄所致精子缺陷有关。最早的基于母血胎儿游离DNA无创产前诊断软骨发育不全的文献由日本学者 Saito H于2000年报道。除了在软骨发育不全疾病检测外，NIPD还在其他常色体显性遺传病如强直性肌营养不良( myotonic dystrophy)、致死性体( thanatophoric dysplasia)、守廷顿病( Huntington disease)等，并且这些验证实验均取得成功。

　　常色体隐性遗传病单基因疾病诊断中，先天性肾上腺皮质增生( congenital adrenal hyperplasia，CAH)是使用NIPD检测的常见疾病之一。先天性肾上腺皮质增生是由于6号染色体上编码21痉化酶的CYP21基因突变导致皮质激素合异常，造成突变纯合子女性胎儿外生殖器男性化。传统的毛穿刺术最早于孕11周进行，而NIPD最早可于6周诊断，早期确定受累胎儿可以免正常胎儿接受不必要的药物治疗，减少用药的副作用。此外，囊性纤维化( cystic fibrosis，CF)、β-地中海贫血等也是利用NIPD获得验证结果的疾病之一。

展望

　　NIPT具有较高的敏感性和特异性，但其与传统的染色体核型分析技术之间存在不一致的情况。目前,染色体核型分析技术为产前诊断的金标准,NIPT检测阳性结果须经有创产前诊断方法证实。随着NIPT不断发展，结合第三代乃至第四代基因测序技术，NIPT在不久的将来将应用于更多临床疾病的检测和研究。