50％终点法测定病毒滴度实验

实验方法原理

实验材料 病毒

试剂、试剂盒 含 2%小牛血清的 Eagle's 维持液

仪器、耗材 细胞培养箱、细胞培养板

实验步骤

1. 制备细胞 先制备好单层细胞培养物，在低倍显微镜下观察，挑选生长良好的细胞，按「传代细胞培养」法进行，将细胞单层洗涤、消化、计数。配制所需浓度的细胞悬液，细胞数目可因细胞种类而异，通常为 20 万 -30 万/ml。预先将微量细胞培养板设计好，标记；用微量加样器将细胞悬液加人微孔中，每孔 200µl。

2. 孵育细胞 将装有细胞悬液的微孔板置于 5% CO2 培养箱中， 37℃培养直至细胞生长成良好的单层。

3. 接种病毒 用含 2%小牛血清的 Eagle's 维持液作为稀释液，将待测病毒作连续 10 倍稀释，如 10-1 、 10-2 、 10-3 …… 10-10 等。将培养板中的培养液全部倾弃，用微量加样器把每个稀释度的病毒液依次、对号加入各个微孔，每孔 100µl, 每个稀释度加 4 孔，同时设细胞对照孔 4 孔，不加病毒，只加稀释液，置于 37℃ 5% CO2 培养箱中培养。

（二）观察结果

于培养后的不同时间，如 18 h 、 24 h 、 36 h 等，在倒置显微镜下观察细胞病变情况。1. 细胞病变程度表示法 通观整个「单层区」，权衡总的情况，以下列符号表示其病变程度：

-：表示无细胞病变。

+：表示 1%~25% 的细胞有病变。

++: 表示 26%~50% 的细胞有病变。

+++：表示 51%~75% 的细胞有病变。

++++: 表示 76%~100% 的细胞有病变。

2. 记录结果 病毒引起细胞病变效应的滴度以半数细胞培养感染量 (50 % cell culture infectious dose, CCID50)表示，即凡能使 50%(半数）细胞出现病变的最高病毒稀释度，即为 50%感染单位，简称 CCID50。有时也称其为半数组织培养感染量 (50 % tissue culture infectious dose, TCID50) 。细胞病变效应出现的时间，不同病毒不完全一样，以感染细胞的病变不再发展，而对照细胞仍完好为准。

（一）CCID50的计算

L 用 Reed-Muench 法计算CCID50

2. Karber 法计算 CCID50

公式： lg CCID50< 或 LD50 、 ID50)=L+d(S- 0. 5)

L—病毒的最低稀释倍数的对数；

d—稀释系数，即组距；

s---细胞病变比值的和（不包括最低稀释度细胞病变的比值）。

（二）ID50 和 LD50的计算

ID50的计算与CCID50完全相同，但依接种动物或胚胎是否受感染而判定，感染与否的判定标准如家兔在接种猪瘟病毒之热反应，鸡胚胎接种新城疫病毒后血球凝集。

LD50计算方法与前两者完全相同，只是判定标准是以接种动物或胚胎是否死亡判定的。

（三） CCID50 与 PFUs 的换算

如果用同一细胞系做 CCID50试验和空斑形成单位 (PFUs) 试验， 1 ml 病毒液将会产生的PFUs 约相当于 CCID50 滴度的一半。此时的感染量为至少在单层细胞上出现 1个病毒空斑，而实际测量时，在单层细胞上可能出现 1个以上的病毒空斑，因此需要按实际测量的空斑数计算。若按数学公式推导，预期的 PFUs 将会超过 CCID50 滴度的一半。因为在 CCID50测量时，阴性代表在单层细胞上出现的空斑数为 0, 阳性代表在单层细胞上出现 1个或 1个以上的空斑。

按照泊松分布的公式 P(O) =e（-m）,P(O) 代表阴性孔数的比例， m 代表 PFUs/ml, 因为任何CCID50的 P(O)=0.5因此， e(-m) =0. 5,m= —ln 0. 5≈0. 7 。所以 0. 7 乘以CCID50的滴度即为预计的 PFUs 。

注意事项

因细胞可受多种非特异因素的影响而发生病变，所以一定要先观察对照组细胞，再观察实验组细胞，同时在观察细胞有无病变时，尚应注意下列问题：

(1) 未适应现象：初分离的病毒或实验室低温保存过久的病毒，当将其感染细胞时，往往在开始时不出现病变，但继续盲传下去即会出现病变。

(2) 无病变现象：有些病毒虽能在细胞内繁殖，但却不出现病变。

(3) 细胞带病毒现象：因很多动物及鸡胚中常常有「潜伏性病毒」而造成细胞带病毒，故在分离病毒时应特别注意这个问题。此外，支原体的污染有时亦会碰到，这是比较难处理的问题。良好的细胞单层应是细胞界限清晰，胞浆内颗粒细致均匀，无融合细胞。