| 实验步骤 | 一、材料与设备
1) 水平电泳装置
2) 水浴
3) 硝酸纤维素膜或尼龙膜
4)3 MM 滤纸
5) 紫外交联仪
6) 杂交管
7) 杂交炉
8）[32P] 标记的 DNA 或 RNA 探针
9)20XMOPS 缓冲液:4l.86 gMOPS,8 g 乙酸钠，72 gEDTA，加 DEPC 水至 300 ml，调 pH 至 7.0
10)20XSSC(3mol/LNaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠，PH7.0):175 gNaCl,88 g 柠檬酸三钠•2 H2O，加水 800 ml，用 l0mol/LNaOH 调 pH 至 7,0, 定容至 l000ml
11）50XDenhardt 液：5 gFienll(type100),5 g 聚乙酰吡咯烷酮 (pvp)，5 g 牛血清蛋白，加 DEPC 水至 500 ml,-20℃ 保存
12) 杂交液：50%(m/V）甲酰胺（去离子），5XSSC1%(m/V)SDS，5XDenhardt 溶液 100ug/ml,tRNA 或鲑精 DNA
13)10%SDS
二、操作方法
(一）通过毛细管原理转移 RNA 至膜上
1) 通过变性琼脂糖凝胶电泳时总 RNA 或 poly(A)+RNA 进行分离
2) 电泳后，将胶管于 DEPC 水配制的 O.O5mol/LNaOH 浸泡 30 min;DEPC 处理的水漂洗,10 倍体积 20XSSC 浸泡 45 min.
3) 将硝酸纤维素膜和滤纸用 20XSSC 浸泡 10 min 不要直接用手或脏手接触滤膜
4) 按下图 5.1 所不，依次放置滤纸、凝胶，硝酸纤维素膜，滤纸、纸巾、玻璃板和 500 g 的重物，并在凝胶的四周用窄的封门膜条环绕，利用纸虹吸转移过夜，其间换纸巾 2〜3 次
5) 用 1XSSC 淋洗硝酸纤维素膜并晾干，在紫外交联仪中用短波紫外线照射或真空炉于 80℃ 烘烤 lOmin，使 RNA 固定于膜上。可用保鲜膜将滤膜包裹起来存于 4℃ 备用或立即使用
(二）探针的标记
用随机引物标记试剂食对 DNA 探针逬行标记。并用柱子如 ElmipD 柱(Schleicher&Schncl1、Keene、NH) 对其进行纯化
(三）预杂交和杂交
1) 用 1XSSC 缓冲液将膜浸湿，置于杂交瓶中
2) 加入杂交液，42℃ 预杂交 8〜12 h 以封闭非特异性结合位点。
3) 替换新的杂交液，将已标记好的探针煮沸变性 lOmin，取出后立即置冰浴 lOmin，将变性探针加入新的杂交液中，42℃ 杂交 20 h
(四）洗膜和检测
1) 杂交完毕后，迅速加入大量 2XSSC/0.5%SDS 室温下振荡洗膜 5 min, 再用 IXSSC/0.1%SDS 室温下继续振荡漂洗 15 min; 换用大量 0.1XSSC/0.1%SDS37C 漂洗45mi n,接着换新鲜的同一溶液，65℃ 继续洗涤 45 min。
2) 室温下，杂交膜用 0.1XSSC 稍稍漂洗，然后置于滤纸上吸去膜上液体，用保鲜膜包好，置暗盒中一 70℃ 放射自显影 1〜2 天。
(五）滤膜的再次使用
将尼龙膜浸泡于 50% 甲酰胺、0,1%SSC、0.1%SDS 溶液中，68℃ 保温 1〜2 h，然后室温下用 0.1XSSC 溶液漂洗，用滤纸吸去大部分液体，再次用保鲜膜包裹，放射自显影，检查探针是古已被洗掉，如已冼尽，则按上述预杂交、杂交、洗膜的流程进行第二次杂交，只是这一次换成微球蛋白的探针。 收起 |
|---|
| 注意事项 | 1) 经典毛细管转移法是一种简单可靠的方法，而且由此得出的结果可与任何其他特别设计的转移装置所获得的结果相媲美。
2) 在 Northern 印迹屮，高保真的 RNA 样品和探针是关键。在制备 RNA、电泳、杂交过程屮，为避免 RNA 降解失活，全部试剂和器皿均应灭活 RNA 酶，操作过程中应戴手套和避免说话。
3) 硝酸纤维素膜要充分浸湿。
4) 在 RNA 转移至硝酸纤维素膜之后对 RNA 进行染色。将干燥的滤膜浸入 5% 冰乙酸中，于室温浸泡 15 min，再将滤膜转至 0.5mul/L 乙酸钠（pH5.2) 和 0.04% 亚甲蓝溶液中，于室温浸泡 5〜10 min, 用水浸洗滤膜 5Omin，可见 RNA 标准分子质量参照物带形锐利，总 Poly(A)-mRMA 为一模糊带形，范围为 500〜5000bp,mRNA 的平均大小约为 2kb
5) 通常, 用 [32P] 标记探针进行的杂交仍是 Northern 印迹的最敏感的方法。非同位素标记法可用于较高表达的 RNA 的检测或定量。探针分子质量在 lkb 左右时杂交效果最佳
6) 提高漂洗的严格性可明显提高杂交特异性。严格的漂洗意味着低盐浓度（SSC)和高杂交温度然而在高严格条件下特异性的结合会下降
7) 如果需要额外漂洗或再杂交，滤膜必须保持湿润
8) 杂交和漂洗应在低于 Tm5-15℃ 的条件下进行操作
9) 设计比较性试验时，应考虑 RNA 内参照的设置，通常可用β-微球蛋白的探针作为哺乳动物细胞的 RNA 内参照
10) 通常用 10〜20ugRNA 进行 Northernblot 杂交，可以检测占 mRNA 总量 0.1% 以上的高丰度 mRNA, 如果待测 mRNA 含量极微，每个泳道应加 0.5〜3ugPoly(A)-RNA。 |
|---|
