分子克隆蛋白表达实验指南(一)
目的基因克隆包括保存用全长基因(gene for saving, GS)和表达用全长基因(gene for expression, GE)两部分。 这两部分所克隆的基因都是全长片段,但克隆的策略及目的不同。直接用精确克隆(及引物从基因CDS两端开始)很难找到高效价的引物,且cDNA中目的基因很少,成功克隆出基因很困难。因此我们选择在CDS两端设计高效价引物,先将基因从cDNA文库中克隆,将克隆插入T载体中。之后再设计一对用于精确克隆的引物,以插入目的基因的重组T载体为模板,克隆出用于表达的基因,插入T载体。GS目的基因的拷贝数很高,及时引物效价不高,仍然能获得GE。 全长基因难以获得时(如GC含量较高),可克隆目的基因中800~1000bp的片段用于表达。 1. 细胞复苏及培养 a. 确定细胞复苏用得培养液。培养液使用前37C水浴温育。 ......阅读全文
分子克隆-蛋白表达实验指南(十八)
15%胶 水1.11.872.33.43.854.65.76.99.211.5 30%聚丙烯酰胺混合液2.54.2557.58.751012.5152025 1.5M Tris(pH=8.8)1.32.212.53.84.5556.37.
分子克隆-蛋白表达实验指南(十五)
LB固体培养基 Tryptone 1g Yeast Extract 0.5g NaCl 1g Agar 1.5g 加蒸馏水至总体
分子克隆-蛋白表达实验指南(十七)
Buffers for His purification in denatured conditions: 配制时加终体积50%的水,之后定容至所需体积。先配pH 8.0的buffer(调pH需要较多NaOH),再统一配bufferC,D,E,分别调pH Buffer B (200ml
分子克隆-蛋白表达实验指南(十二)
– Note: The yield of fusion protein can be estimated by measuring the absorbance at 280 nm. The GST affinity tag can be approximated by 1 A280 Å 0.5
分子克隆-蛋白表达实验指南(十六)
Amp(50mg/ml) 溶解1g Amp于足量的水中,最后定容至20ml。分装成小份于-20℃贮存。常以20~50ug/ml的终浓度添加于生长培养基,1:1000比例稀释 Kan(50mg/ml) 溶解1g Kan于足量的水中,最后定容至20ml
分子克隆-蛋白表达实验指南(四)
7. PCR产物与TA载体连接 pGEM-T vector is T-tailed at the insert site. To improve the ligation efficiency, it is recommended PCR product be A-tailed. +A s
分子克隆-蛋白表达实验指南(三)
若有非特异性条带,可进行Touchdown PCR,提高引物的特异性。 PCR反应条件: 1 94C 5min 2 94C 45s 3 65C 45s 退火温度视
分子克隆-蛋白表达实验指南(五)
8. TA质粒转化菌落的验证 与表达载体的验证不同,转化TA质粒时不用双酶切验证。只需用目的基因引物和TA载体引物PCR验证即可。TA载体引物PCR片段比插入片段大约长150bp。 目的基因退火温度与之前胶回收时温度相同,TA退火温度60C即可,但可在55~70之间变动,不会影响结果。 挑取至
分子克隆-蛋白表达实验指南(十三)
7. 电泳结束后,按比例从胶上割下相应约1cm条带(当按比例的条带割下后可相应的向两边再割一点,但是电透析时中间和两边的胶必须分开透析),用镊子或尺子将胶碾碎成2mm见方的小块。 8. 将碎块小心加入电透析tube中,200V,120~150min。 9. 移出放电透析tube的架子,
分子克隆-蛋白表达实验指南(六)
10. 测序 突变后氨基酸序列没有变化仍可用于表达。测序报告中blast时若有‘-’符号,则人工对照测序图谱。 测序验证后没有突变或者同义突变的重组质粒必须小抽,50ul,conc300ug/ml备份。测序文件应妥善保存,蛋白表达完成后一并提交存档。 获得GS后,即可构建含GE的重组T载体,用