ACEHILIC色谱柱方法开发指南ⅣHILIC仪器兼容性

ACE HILIC色谱柱检测器兼容性

HILIC是一种能很好兼容众多主流检测器的技术。因此，检测的（检测器的）选择受检测器可用性、所需的检测限制和分析物的理化特性（即：具有发色团或电荷）等综合因素的影响。

UV-Vis检测器

UV-Vis检测器是分析试验室中最常见的检测器之一。

根据仪器的不同，一次可记录多个波长，以优化分析物覆盖范围。

有时，混合物中的分析物可通过参考紫外光谱库来快速识别。

图10中的例子示出了五种β受体阻滞剂的分离，这些阻滞剂可通过他们不同的图谱清楚识别（识别清楚）。

图10

五种β受体阻滞剂的色谱图和紫外光谱

色谱柱：ACE 5 HILIC-N，150 x 4.6 mm

流动相：10 mM甲酸铵pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）

流速：1.5 mL/min

温度：25 °C

检测：UV, 214 nm

样本：

1) 普萘洛尔

2) 醋丁洛尔

3) 索他洛尔

4) 沙丁胺醇

5) 阿替洛尔

折射率检测器

示差折光测器（RID）测量当通过检测器时分析物峰相对参考溶剂（即流动相）的折射率。如果这二者之间存在差别，色谱图中可观察到峰。

RID对缺乏活性发色团的分析物很有用，尤其常用于糖分分析。

RID存在几个方面的劣势。这些劣势包括灵敏度受限和没有峰相关的信息（峰的身份通常需要单独的标准来验证）。

此外，RID只能用于等度条件，因为洗脱剂（洗脱剂组成变化）会改变折射率响应。

作为物理测量，折射率也很受温度的影响，也就是说，基线噪声和再现（重现）性会发生变化。

蒸发光散射检测器

蒸发光散射检测器（ELSD）通过如下方式工作：从LC上喷射输出洗脱液与惰性气体（通常为氮气），以形成液滴在加热室内去溶剂化。

去溶剂化后的分析物被分散的光源击中，然后进行检测（喷射出惰性气体来雾化从LC中输出的洗脱液，形成液滴后在加热管中蒸发，去溶剂的分析物被分散的光源击中然后进行检测）。

探测器（ELSD）需要挥发性洗脱剂，以使HILIC非常适合（HILIC方法就非常适合这款检测器）。ELSD是RID有效的替代选择，因为它非常适合非（无）发色团分析物，灵敏度更高，并且适用于梯度色谱法。

但是，ELSD不提供光谱信息，因此在没有标准的情况下，较难识别峰值（峰的识别很困难）。

对于HILIC分离（分析物），ELSD对发色团有限（有限发色团）的极性分析物更有利，例如甲基丙二酸（MMA）和琥珀酸（图11）。

MMA用作维生素B12缺乏症的生物标志，但琥珀酸与MMA等压（元素相同），因此必须彻底解决以防止假阳性结果。

采用ELSD的HILIC法，其MMA量化比紫外线检测法更好。

图11

甲基丙二酸和琥珀酸的色谱图

色谱柱：ACE 5 HILIC-B,

150 x 4.6 mm

流动相：10 mM

甲酸铵pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）

流速：1.5 mL/min

温度：25 °C

检测：ELSD

样本：

1) 琥珀酸

2) MMA

质谱仪

质谱仪（MS）是LC分离中信息最丰富的检测技术。

LC的洗脱剂流通常使用惰性气体（如氮气）去溶剂化（LC流出的洗脱液在加热管中被惰性气体去溶剂化），并在检测前电离。

可使用不同的质谱分析仪，如：四极质谱仪、飞行时间质谱仪、离子阱质谱仪等。有机物含量较高的HILIC洗脱剂特别适合MS检测。

有多个电离源可用，根据具体应用进行选择。

喷雾电离质谱（ESI）很常用，但也使用电晕放电和光电离源。MS具有高度专一性，因为可利用选择性离子检测（SIM）进行跟踪（因为可以使用选择离子性监测来跟踪单个物质的荷质比（m/z），得到更好的选择性），提高灵敏度。MS还可以在不同质量范围内执行扫描，这对未知的样本（样品）很有帮助。

但是，MS扫描通常灵敏度小得多。（具有更小的灵敏度。）

MS可用于检测发色团较弱或者没有发色团的分析物。

作为一种识别工具，MS对HILIC应用也很有帮助，这种应用中分析物具有相似的紫外光谱特性，但质量不同（在HILIC应用中，当分析物具有相似的紫外光谱特性，但质量不同，MS是很有用的识别工具）。

核酸碱基和核苷就是一个很好的HILIC例子。极性分析物腺嘌呤、腺苷和2’-脱氧腺苷的紫外光谱非常相似（图12）。

图12

腺嘌呤、腺苷和2’-脱氧腺苷的紫外光谱对比

蓝色轨迹：腺嘌呤

红色轨迹：腺苷

绿色轨迹：2’-脱氧腺苷

色谱柱：ACE 5 HILIC-N，150 x 4.6 mm

流动相：10 mM甲酸铵，pH4.7（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）

流速：1.5 mL/min

温度：25 °C

检测：UV

进样量：2 μL

MS可利用这些分析物不同的质荷比进行检测和识别峰（图13）。SIM用于提高灵敏度。

图13

利用UV和MS联合检测法分析ACE HILIC-N的腺嘌呤和核苷

（a）下列物质的紫外光色谱图：

1) 2’-脱氧腺苷（m/z 252.4）

2) 腺嘌呤（m/z 136.1）

3) 腺苷（m/z 268.3）

(b) 通过MS SIM确认峰

色谱柱：ACE 5 HILIC-N，150 x 4.6 mm

流动相：10 mM甲酸铵，pH4.7（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）

流速：1.5 mL/min

温度：25 °C

检测：UV，254nm和MS