BAC／PAC文库的构建

EcoRⅠ消化的基因组DNA 载体DNA 电转化感受态细菌细胞

5 X 缓冲液 EDTA 蛋白水解酶K PMSF 缓冲液 Not I 限制酶和缓冲液 琼脂糖溶液 0.5 X TBE 缓冲液

SOC 培养基 LB 平板 LB 培养基 水浴锅 激孔透析膜 离心管 轨道混合器 自动质粒隔离系统 软质塑料96孔板

1.目标区域的大小

（1）如果基因组的目标区域很小（小于50kb），那么可以选择黏粒载体甚至是λ噬菌体载体。利用现有的商品化的黏粒载体、高效率的包装混合物和合适的大肠杆菌菌株，研究者可以方便的构建黏粒载体文库。

（2）如果基因组的目标区域比较大，那么P1、PAC或者BAC就比较合适了。P1操作比较困难，PAC相对简便。BAC载体也是很好的选择，研究者可以利用现有的成熟产品来构建BAC文库，比如EPICENTRE公司的一系列BAC载体及配套试剂盒。

（3）如果目标区域非常大（大于250kb），那么YAC载体就是首选了。不过，应用YAC载体来构建基因组文库，操作非常繁琐困难，一般由专门的公司来完成。

2.筛选文库的难易程度

黏粒载体一般使用传统的滤膜影印杂交来筛选，但是这种方法对于构建区域图谱及叠连群来说既费力又浪费。大容量载体文库，如P1、PAC、BAC、YAC，以二维阵列保存，既可以用传统的单拷贝的探针杂交法筛选，又可以用PCR进行多克隆的群体筛选。而且，使用高容量载体构建文库，可以减少染色体步查的步骤。

3. 载体拷贝数的考虑

当把大片段DNA片段克隆到高拷贝的载体时，克隆DNA会发生重组，从而影响克隆序列的保真性和稳定性；而单拷贝载体的低产量DNA是高通量分析的瓶颈。这个矛盾常常困扰着研究者。而EPICENTRE's CopyControlTM 克隆系统是对这些困难的最好的解决方案。CopyControlTM技术整合了单拷贝载体与多拷贝载体的优点。单拷贝载体能提高插入片段的稳定性，而且拷贝载体能在诱导剂的作用下，即时扩增出高拷贝数的克隆而获得高产量的DNA。

四、将基因组DNA片段连接入载体

使用连接酶把上述大小合适的DNA片段连接入载体。商业化载体已经经过预处理，可以直接使用，无需内切酶消化及脱磷酸化处理。连接反应体系以100ul为宜。

注意：BAC载体连接完以后，需要将连接产物做脱盐处理，除去连接反应缓冲液里的盐分。

五、将重组载体转入宿主细胞

1. 如果使用Epicentre试剂盒构建黏粒文库，需要用Epicentre MaxPlax Lambda Packaging Extracts 来包装上述的连接反应产物，测定包装好的黏粒克隆的滴度，然后转染Epicentre EPI300-T1?Plating Strain。挑出重组子，鉴定插入片段的大小。如果文库的大小和质量都令人满意的话，就可以铺板进行文库筛选，或者扩增、保存文库。

2. 如果使用Epicentre试剂盒构建BAC文库，应选择电转法，可以选择Epicentre TansforMaxTM EPI300TM Electrocompetent E.coli 作为宿主，将上述连接产物转入细菌，涂板长出克隆后。获得克隆，研究者需要对BAC克隆的大小进行评估，确定文库大小是否能够满足要求。Epicentre 文库构建试剂盒中的EPILyse和EPIBlue，快速裂解克隆并电泳，可以方便的鉴定出BAC克隆的大小，从而估计出BAC文库的大小。如果文库大小合适，那么这个文库就可以进行后续的操作了。

六、文库克隆数的确定

基因组DNA文库需要包含足够多的克隆，来保证文库的代表性。一般使用如下的经验公式来确定：

N = ln （1-P ） / ln （1-f ）

P是希望得到的覆盖率，f是插入片段大小与基因组DNA大小的比值，N是所需的克隆数。

举例来说，用BAC载体构建人类基因组文库，人类基因组大小为3 x 109 bp, 插入片段大小为100kb，希望覆盖率99%，那么所需要的BAC克隆数为：

N = ln （1 - 0.99） / ln （1 - [106bp / 3 x 109 bp]） = -4.61 / -3.33 x10^-6= 138,298