CRISPR正推动CART细胞快速前进

　　随着人们对免疫治疗兴趣的增长，对更好的CAR-T细胞制造工具的需求也在增长。CRISPR技术的进步能解决这个问题吗？

　　在过去的十年里，一种新的免疫治疗工具进入了临床。被设计成表达嵌合抗原受体的T细胞，即CAR-T细胞，已经被证明可以帮助血癌患者。2011年的一项关键研究使用第二代CAR-T细胞来实现大多数测试患者T细胞的持续激活和缓解。

　　一年后出现了另一个重大突破，两个小组描述了一种名为CRISPR-Cas9的新型基因编辑工具，并演示了它在真核细胞中的应用。这两份报告帮助开启了基因编辑的新时代。

　　尽管基因编辑有可能改善细胞工程，但CAR-T细胞和CRISPR的交叉还需要几年时间。

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　　寻找方法

　　从一开始，CAR  -T细胞就显示出了巨大的杀癌潜力，但制造这些细胞既繁琐又复杂。

　　最初，T细胞工程依赖于慢病毒或逆转录病毒载体将DNA片段导入细胞进行同源重组。病毒载体允许DNA片段的稳定整合和长期表达。然而，获得这些载体所需的临床级试剂非常昂贵，而且这些载体只能携带有限数量的DNA，而这些DNA有可能随机整合到基因组中。

　　为了推进CAR-T细胞治疗，研究人员需要找到一种更有效的方法来设计长CAR序列。

　　CRISPR驱动CAR的发展

　　从一开始，CRISPR就像是制造T细胞的理想方法。这是一个简单的过程，具有最小的脱靶效应，适用于多种细胞类型。但CRISPR在一个领域遇到了困难。

　　CRISPR-Cas9通过产生靶向双链DNA (dsDNA)断裂，然后通过细胞的非同源末端连接途径修复，从而有效地产生小的突变。然而，当使用同源导向的修复机制插入外源DNA时，CRISPR编辑的效率可能低得可怜。然而，插入DNA对于制造CAR-T细胞至关重要。

　　位于奥马哈的内布拉斯加大学医学中心(University of Nebraska Medical Center)的基因工程师Channabasavaiah Gurumurthy表示："Easi-CRISPR是一种更好的工具，适用于同源性导向修复。"

　　Gurumurthy和他的合作者发现，当使用CRISPR将DNA插入细胞时，长单链DNA (ssDNA)是比双链DNA更有效的模板。使用Easi-CRISPR，长ssDNA与含有Cas9和导向RNA的预组装复合物一起被注入，导致更高的靶标编辑率和更低的脱靶编辑率。之前的报道显示，化学合成的具有2-甲氧基和硫代磷酸基团修饰的单导向RNA (sgRNA)增强了原代细胞的细胞内稳定性和编辑效率。此后，CRISPR-Cas9似乎开始成为T细胞内产生缺失和插入的有效工具。

　　去年，Alexander Marson、Gurumurthy和他的同事们利用Easi-CRISPR对人类T细胞的结构和功能进行了重新编程，且不需要病毒载体。本研究表明，将ssDNA作为同源性导向的修复模板对T细胞进行CRISPR编辑，与dsDNA模板相比，能够更准确、更有效地进行大规模的基因插入，并且脱靶整合概率更低。

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　　展望未来

　　虽然有希望，但还有一个重要的考虑。"长ssDNA序列很难在实验室中产生，尤其是在基因编辑实验中需要高浓度的长ssDNA，" Marson实验室的成员、该研究的第一作者Theodore Roth说。

　　一些公司和研究开发人员正试图解决这个问题，他们正在研究有效生成大量长ssDNA的方法。总部位于新泽西州皮斯卡塔韦(Piscataway)的全球生物技术公司GenScript以其领先的DNA合成技术而闻名。该公司最近开始提供数千个核苷酸长度的ssDNA，数量可达100微克--这是使用CRISPR进行T细胞重编程的理想选择。GenScript也是为数不多的提供完整的CRISPR解决方案的公司之一，包括HPLC纯化的、化学合成的sgRNAs，并通过末端修饰来增强CRISPR编辑。

　　基因编辑正在改变研究人员研究细胞工程的方式。像Easi-CRISPR这样的方法，连同DNA和RNA合成的改进，将进一步加强CAR-T细胞工程的努力，最终改善癌症治疗和人类健康。

　　参考资料：

　　【1】CRISPR expands CAR T cell possibilities

　　【2】Porter， D.L.， et al. Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia. N Engl J Med 365， 725-733 (2011). DOI： 10.1056/NEJMoa1103849

　　【3】Jinek， M.， et al. A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science 3337， 816-812 (2012). DOI： 10.1126/science.1225829

　　【4】Cong， L.， et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science 339， 819-823 (2013). DOI： 10.1126/science.1231143

　　【5】Miura， H.， et al. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nat Protoc. 13， 195-215 (2018). DOIhttps：//doi.org/10.1038/nprot.2017.153

　　【6】Hendel， A. et al. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nat. Biotechnol. 33， 985-989 (2015). DOIhttps：//doi.org/10.1038/nbt.3290

　　【7】Roth， T.L.， et al. Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting. Nature 559， 405-409 (2018). DOI https：//doi.org/10.1038/s41586-018-0326-5