CellRes:中国学者用韩春雨基因编辑新技术研究斑马鱼

　　2016年，生命科学界的一个热门人物，当属河北科技大学生物科学与工程学院生命科学系副教授韩春雨。在今年的5月份，他作为通讯作者在国际学术期刊《Nature Biotechnology》提出一种新的基因编辑技术——NgAgo-gDNA，向当前最火热的“第三代”基因编辑技术CRISPR-Cas9发起了挑战。（韩春雨：“冷板凳”上坐出科学新秀）

　　韩春雨及其团队的发现被一些人称作是“第四代”基因编辑技术。然而，之后的故事急转直下，全球数百家实验室，历时5个月的时间，没有一家宣布能重复成功（韩春雨基因编辑技术在数百个基因中均重复失败）。质疑声越来越大，韩春雨不作正面回应，却收获接连的荣誉：河北科协副主席、美丽河北最美教师、100万元国家自然科学基金……受惠于NgAgo技术，河北科大获得了河北发改委2.24亿元的财政拨款，用于建设河北科技大学基因编辑技术研究中心。

　　刚刚过去的10月份，有13位生物学家一致表示，希望韩春雨能公开所有原始数据，韩春雨所在河北科技大学及其他相关单位（如：国家自然科学基金委员会）启动学术调查（13位科学家实名呼吁对韩春雨启动调查）。也有科学家对此提出了不同意见（高福院士谈如何看待韩春雨事件：是否有真正的科学发现才是关键）。一时间，韩春雨以及他的NgAgo基因编辑技术，陷入了风口浪尖之中。

　　11月11日，当大家还沉浸在双十一购物狂欢的时候，《Cell Research》杂志以Letter to Editor形式在线发表了来自南通大学和复旦大学研究人员合作完成的一项研究，题为“NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish”，这项研究的结果表明，gDNA/NgAgo 系统在斑马鱼中能实现特定基因敲低，导致鱼眼部发育缺陷，但是不能对靶基因进行基因编辑。

　　这篇论文的通讯作者是南通大学江苏省神经再生重点实验室的刘东副教授，根据该实验室官网资料显示，刘东于2011年从德国马克斯-德尔布吕克分子医学中心/柏林自由大学获得自然科学博士学位，从2012年8月起任南通大学神经再生重点实验室副教授，2013年起担任硕士研究生导师。论文的另一位合作者，是来自复旦大学生命科学学院的王永明研究员，他曾于2015年入选中组部青年千人计划，主要研究方向是建立高效的CRISPR/Cas9基因编辑技术用于通过建立疾病模型和筛选相关治疗药物等。

　　脂肪酸结合蛋白11a（Fabp11a）是细胞内的FABPs家族中的一个成员，它对于调节糖和脂质代谢平衡以炎症，扮演着重要的角色。到目前为止，Fabp11a在斑马鱼胚胎发育中的作用还不清楚。为了探讨5′-磷酸化的单链（ss）DNA是否可以指导NgAgo在体内破坏斑马鱼的内源基因，该研究小组为斑马鱼构建了一个密码子优化的NgAgo，在N-末端和C-末端具有核定位信号（NLS）肽（NgAgo-2nls）。

　　研究人员针对Fabp11a合成了两个24bp的5’-磷酸化ssDNA寡核苷酸，并把每一个与NgAgo-2nls mRNA共同注射到1细胞期的胚胎中。有趣的是，他们观察到，大约30%的注射胚胎表现出重度眼部表型，要么是一只非常小的眼睛和一只相对正常大小的眼睛（1型），要么是在头顶有一只大的融合眼，就像独角龙一样（2型）。

　　为了探讨眼表型是否是由fabp11a基因突变引起的，研究人员提取了具有异常眼部表型的胚胎的基因组DNA，并对靶区域进行聚合酶链反应（PCR）扩增。测序结果表明，靶基因没有发生任何基因突变，但是通过RT-PCR检测发现，Fabp11a基因的表达惊奇的发现该基因的表达有显著下调。

　　为了更清楚的说明问题，作者进一步做了一些实验，排除了单独由NgAgo-2nlsmRNA或者gDNA注射到胚胎所导致的表型，而且同时注射NgAgo-2nlsmRNA和错配的gDNA也不会产生表型，这些实验结果表明，gDNA/NgAgo系统有其特异性。另外的实验结果表明，gDNA/NgAgo系统靶向敲低Fabp11a基因所导致的斑马鱼眼部异常表型，可以通过注射Fabp11amRNA修复。为了进一步确认gDNA/NgAgo系统在斑马鱼中敲低基因是一种普遍的现象，作者又检测了另外一个基因ta（no tail/ntl or brachyury），结果表明也有大约30%注射过的胚胎表现出没有尾巴的表型。

　　此前，韩春雨在《Nature Biotechnology》的文章中表明，gDNA/NgAgo系统在人源细胞（37℃）中能够有效地产生11.2%至41.3% 的插入。在《Cell Research》这篇文章中，研究人员也在37℃的条件下检测了斑马鱼中gDNA/NgAgo系统是否能产生插入，结果表明没有检测到任何插入发生。有趣的是，在正常情况下，斑马鱼胚胎中注射gDNA和酶活突变的NgAgo mRNA也能产生系列表型，当然同样检测不到任何插入的发生。为了再进一步确认斑马鱼的表型是由于Fabp11a敲低造成的，作者还做了一些后续的原位杂交实验，而且还运用CRISPR/Cas9技术敲除Fabp11a基因，也能得到相似的表型，当然基因敲除的表型显然异常剧烈一些，有大约10%的胚胎表现出了眼睛消失的表型。

　　总而言之，这项研究结果通过使用gDNA/NgAgo系统在斑马鱼中实现了特定基因的敲低，但是，并没有检测到靶基因上出现任何的插入，因为酶活突变的NgAgo也能产生敲低的效果，作者猜测，该系统可能和酶活突变的Cas9：sgRNA系统类似，都能在靶基因处抑制基因转录。作者最后指出，gDNA/NgAgo系统能够为斑马鱼基因敲除提供一种替代策略。