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Protocol

1 调制protein A sapharose

protein A sapharose 5ml 溶于20ml含0.02%NaN3的PBS

离心2000转2分，去上清，在沉淀加0.02%NaN3的PBS，离心后去上清，重复2次，最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS，冷藏保存

用单抗做一抗时，把protein A sapharose先用抗鼠Ig兔血清处理(每50ulprotein A sapharose用1-5ul血清)。旋转1-2h,混匀后，再离心1-2s

去上清后，加PBS，vortex混合，离心去上清，重复二次

加含0.02%NaN3的PBS到原来体积，冷存。避免长期保存。

2．抗原的检出
以下操作全在冰面或4度进行

去除细胞培养液，用冷PBS洗一次。加RIPA，溶解后，转移到eppentube中用vortex混匀。RIPA的量：6cm的培养皿加1 ml(蛋白质的量为500mg/ml),组织块用液氮粉碎，在缓冲剂中捣匀，蛋白定量。

30m，15000rpm离心，上清转移到新tube 。不用移液枪，直接从tube倒进另一个tube

往上清加抗体，1ml加2-5ul抗体，冷室内旋转混匀1h

加protein A sapharose50ul，再混匀1h

5000rpm离心1s,使sapharose沉淀，去上清。往sapharose加RIPA，vortex 混匀，离心，去上清。重复4次洗净。

加电泳用 sample 缓冲液40ul,2m煮沸，泳动后，固定/干燥胶，现像。

3.注意点
A：不熟练使用移液枪，会混入沉淀的不溶性蛋白，使实验失败。对无论怎么也除不去的混入蛋白，只使用上清的上半部，或用超速离心机。
B：对电泳的非特异条带，最后可依次用含300mM，1omMNaCl的RIPA洗净各一次。(完)